高分子聚合材料表面潤濕性對成纖維細胞貼附能力的影響

[摘要]目的：研究高分子聚合體表面潤濕性對成纖維細胞初期貼附能力的影響。方法：使用薄膜等離子體聚合法在圓形蓋玻片表面生成六甲基二硅氧烷(Hexamethyldisiloxane， HMDSO)薄膜聚合體，然后用低溫氧等離子體轟擊聚合體表面，根據轟擊時間的不同形成一系列的不同潤濕性表面，將成纖維細胞系L929接種于不同潤濕性表面，觀察6h、12h時細胞的貼附率，并觀察細胞的形態。結果：隨著氧等離子體轟擊時間的增加，HMDSO聚合體表面接觸角從106°下降為0°，顯示表面由高度憎水變為高度親水。成纖維細胞在親水表面較憎水表面有更高的早期貼附率，細胞伸展更充分。結論：高分子聚合體的表面潤濕性對成纖維細胞的早期貼附和伸展有顯著的影響。親水性表面更有利于細胞的早期貼附和伸展。

[關鍵詞]表面潤濕性；等離子體聚合物；接觸角；細胞貼附

[中圖分類號]Q647[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）07-1018-03

Adhesion of fibroblast on polymer surfaces with Different Wettability

WEI Jian-hua 1，FENG Xing-hua1，ZHANG Jun-rui1，LIU Bao-lin3， Masao YOS HINARI2

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，School of Stomatology，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2.Department of Dental Materials Science; Tokyo Dental College，1-2-2 Masago; Mihama-ku， Chiba 261-8502，Japan)

Abstract:ObjectiveTo study the initial stage cell attachment of fibroblast on polymer surfaces with different wettability. MethodsHexamethyldisiloxane polymer film was obtained by plasma polymerization method on coverslips. Oxygen (O2) plasma treatment was employed to modify the surfaces with different time so that a series of surface with different wettability were produced. L929 cell were cultured on these surfaces to observe the cell attachment rate and cell spreading in 6 and 12 hours. ResultsThe contact angle of HMDSO surface decreased gradually with the increasing duration of the plasma treatment. Fibroblasts tended to attach more on hydrophilic surfaces than on hydrophobic ones. ConclusionCells initial attachment and spreading is significantly affected by polymer surface wettability. The hydrophilic surfaces shows more favorable for cell initial attachment than the hydrophobic ones.

Key words:surface wettability; plasma-polymerized polymer; contact angle; cell attachment

生物高分子聚合材料在整形美容外科有著廣泛的應用，這些材料的生物學相容性對于手術的成敗有著重要影響。這些聚合材料的表面性狀研究也一直是生物材料研究關注的熱點，其中表面能是影響材料生物學相容性的重要因素之一[1-5]。表面能可以用表面潤濕性來體現，有研究表明表面潤濕性對細胞的生物學相容性有一定的影響。本課題研究了高分子聚合體表面潤濕性對成纖維細胞早期貼附和伸展的影響。

1材料和方法

1.1 六甲基二硅氧烷聚合體表面的制作：使用薄膜等離子體聚合法（plasma polymerization），在圓形蓋玻片（Thermanox， Nalge Nunc International， USA）表面生成六甲基二硅氧烷薄膜聚合體。具體步驟如下：①將圓形15mm蓋玻片置入等離子聚合儀(VEP-1000，ULVAC Inc，Japan)，聚合溫度為125℃；②將聚合腔抽真空，真空度設定5×10-3 Pa。3 HMDSO單體被加熱70℃氣化后按照流量為45sccm (standard cubic centimeter/min，ml/min)被引入聚合腔內；③當腔內壓力達到10Pa且穩定以后，開始等離子放電過程（frequency generator at 13.56 MHz），輸出功率200W，放電時間10min；④聚合結束后將氮氣引入反應腔至大氣壓。處理過的蓋玻片表面生成厚度約為100nm的HMDSO聚合薄膜。將處理好的蓋玻片表面以氮氣清潔后放置到細胞培養用滅菌24孔板內備用。

1.2 低溫等離子體處理：將部分步驟1.1制作的HMDSO蓋玻片重新引入等離子聚合儀的反應腔內，處理面向上，用低能量氧進行低溫等離子轟擊，處理條件為功率10W， 腔內壓強1.8 Pa，流量 50 sccm。處理時間分別為20s，40s和80s。 轟擊后將氮氣引入反應腔至大氣壓，取出后進行表面接觸角的測量。

1.3 表面接觸角測定：每種條件取3個樣本，用接觸角測定儀（CA-P， Kyowa Interface Co. Ltd.， Japan）測定試樣的表面接觸角，在每個標本的3個不同位置滴雙蒸水10μl，讀取接觸角并取平均值。

1.4 細胞貼附率測定：將以上處理的三組標本及未行氧等離子體處理的標本每種6片放入24孔細胞培養板中。將L929細胞配制2.5×104cells/ml的細胞懸液，每個培養孔內加入細胞懸液1ml，相當于每個試樣上接種的細胞數量為2.5× 104。在細胞培養箱內培養時間在第6h和第12h時，每組標本取出3片，以PBS輕輕漂洗未貼附的細胞后，置入新的24孔板內，每個孔內加0.5ml1%胰蛋白酶溶液，消化細胞5min后加入0.5ml MEM+10% FBS終止消化作用，每孔內溶液量為1ml。細胞計數采用細胞技術儀Coulter Counter Z1 (Beckman Coulter， Inc. USA)。取平均值作為細胞貼附值，將細胞貼附數除以接種基數后可以得出細胞貼附率。

1.5 細胞形態電鏡觀察：將部分試樣用于電鏡標本觀察，首先將標本用PBS漂洗未貼附的細胞，用2%多聚甲醛固定后，系列酒精脫水，凍干噴金后用掃描電鏡(JSM-6340F；JEOL， Japan)觀察細胞形態。

1.6 統計分析：采用SPSS11.0軟件對實驗數據進方差分析。

2結果

2.1 表面接觸角數據：HMDSO聚合體表面的接觸角為106°，屬于高度疏水性表面。經過低溫氧或氮等離子體處理后表面接觸角明顯降低，在氧等離子體處理80s后表面接觸角降為0°，轉化為高度親水性表面。接觸角與等離子體處理時間呈現負相關性。如表1所示。

2.2 細胞貼附測定：L929細胞貼附測定結果如表2所示，細胞貼附率見圖1所示。結果表明在接觸角為106°的HMDSO表面上細胞貼附很差，而隨著表面潤濕性的增加（接觸角減?。?，細胞貼附顯著性增高。

2.3 掃描電鏡結果：如圖2所示，可見在106°的HMDSO表面上細胞呈球形，細胞伸展很差，而在氧等離子體處理80s，接觸角為0°的表面上，細胞伸展良好，呈片狀。

3討論

在整形美容外科領域，生物高分子材料應用越來越廣泛，從軟組織擴張器、輸血材料到襯墊材料。有關材料學表面的研究也層出不窮，實驗證明，材料的許多表面性狀都直接影響到其生物學相容性，如表面形貌、表面電荷、表面能、表面基團等等都會影響到細胞的貼附增殖或者蛋白質的粘附[1，2，5]。相應的，學者們使用了許多方法來改變生物材料的表面性狀以改善其生物學相容性，其中低溫等離子體處理越來越引起研究者的關注。在本研究中我們著重觀察了氧及氮等離子體處理對六甲基二硅氧烷薄膜聚合體表面性狀的影響。

HMDSO【(CH3)3SiOSi(CH3)3】是一種有機化工及醫藥化工生產中常用的原料，主要用作封頭劑、清洗劑、脫膜劑等，沸點100℃，該材料無毒，是一種生物惰性材料。該材料可以用等離子聚合的方法成膜，聚合體表面接觸角較大，適合用來作為研究低溫等離子體轟擊效應的靶材料。

低溫等離子體用來改善表面的應用曾有學者報道過[6-7]，均證明各種等離子體包括Ar，O2，NH3及N2等都能在一定程度上改善材料的表面潤濕性。本研究結果也證明經過低溫等離子體處理后，HMDSO表面接觸角明顯下降，80s的氧等離子體處理由未處理前的106°降低到0°實現了由憎水性表面向親水性表面的轉化。說明表面潤濕性有了明顯的增加。

根據高分子材料不同的用途，需要細胞盡快貼附或者延遲貼附。本研究著眼于觀察材料的表面潤濕性對細胞早期貼附的影響。以往也有一些學者做過這方面的研究，但是采用的是不同的材料或者表面潤濕性模型的接觸角范圍很窄，難以很好的反映單純表面潤濕性的生物學效應[8-10]。在本研究中，采用了單一的材料，表面接觸角范圍從106°到0°，對于研究表面潤濕性是一種合適的模型，實驗結果表明，未經氧等離子體處理的HMDSO表面接觸角為106°，屬于高度疏水性表面，細胞在這種表面上初期貼附量很少，而且電鏡結果也顯示，細胞的伸展性較差，呈球形，細胞突起較少。而在經過氧等離子體80s處理后，材料表面的接觸角變為0°，屬于高度親水性表面，細胞早期就可見到良好的貼附，細胞的貼附率與表面接觸角呈顯著的負相關性，在親水表面上細胞伸展良好，突起很多，呈梭形。這個結果和大部學者的研究結果一致[10-11]。

有關這種結果的機理，我們的前期實驗結果證明經過等離子體處理后，表面親水基團明顯增加，從而增加了表面的潤濕性，表現為接觸角的下降，這種效應可能對于一些粘附蛋白如Fibronectin、Vitronectin等的吸附有著直接的影響，從而影響到細胞的初期貼附和伸展能力。

總之，本研究利用氧等離子體處理的方法，在很大范圍內改變了高分子聚合物的表面潤濕性，表面潤濕性的降低有利于成纖維細胞的早期貼附和伸展。

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[收稿日期]2008-05-15[修回日期]2008-07-06

編輯/張惠娟