智生膠囊Ⅰ號方對老年癡呆模型大鼠ＭＡＯ、β－ＡＰ及ＣＡＳＨ－Ｐｘ活性影響的實驗研究

　　摘要：目的：研究智生膠囊Ⅰ號方(ZSJN)對老年癡呆模型大鼠智力、單胺氧化酶(MAO)、β－淀粉樣蛋白(β－AP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的影響，探討其防治老年癡呆的作用及機理。方法：應用腹腔注射D－半乳糖制成老年癡呆大鼠，應用Morris水迷宮法判斷大鼠的學習記憶能力，采用生化及其放免法測定其腦內(nèi)MAO活性、β－AP及GSH-Px含量。結果：與正常組大鼠相比，模型組學習記憶能力明顯降低。應用“智生膠囊Ⅰ號方”預防和治療后，模型鼠學習記憶能力得到保護和改善，腦組織MAO活性降低、β－AP含量減少、GSH-Px酶升高。結論；智生膠囊I號方能明顯增強模型大鼠學習記憶能力，通過降低單胺氧化酶活性，降低β－AP，升高GSH-Px酶活性來實現(xiàn)對老年癡呆模型鼠預防和治療作用。
　　關鍵詞：老年癡呆；單胺氧化酶；β－淀粉樣蛋白；谷胱甘肽過氧化物酶；實驗研究
　　中圖分類號：R285.5　文獻標識碼：A　文章編號：1007－2349(2008)03－0036－03
　　
　　老年癡呆即“阿爾茨海默病”(Alzheimer Disease；AD)，是發(fā)生于老年前期或老年期，以進行性癡呆，認知障礙為主要癥狀，同時伴有精神行為異常的精神退行性疾病。其特征性臨床表現(xiàn)為嚴重的學習記憶功能下降，分析判斷能力衰退，情緒改變，行為失常，甚至意識模糊。由于AD的病因病機尚未明確，所以對該病還無特效藥。現(xiàn)代醫(yī)學所使用的藥物大多處在臨床實驗中，而且毒副作用大。中醫(yī)學具有悠久的歷史，其豐富的藥物種類為其提供了龐大的資源庫。“智生膠囊Ⅰ號方”是導師王景洪教授根據(jù)多年來的研究心得。結合中醫(yī)理論和現(xiàn)代藥理研究創(chuàng)制而成，方以人參、熟地、菟絲子、川芎、菖蒲、遠志、銀杏葉組成。具有益氣補血填精、化痰祛瘀開竅、健腦益智強記之功，在臨床應用中有較好療效。現(xiàn)就以該藥對模型大鼠腦組織的MAO活性、β－AP及GSH-Px含量的影響方面進一步探討其作用機制。
　　
　　1　實驗材料
　　
　　1.1　實驗動物　SD大鼠60只，雄性，6月齡，體重(300±50)g。由西安交通大學醫(yī)學院驗動物中心提供(醫(yī)動字第08－005號)
　　1.2　實驗用藥及試劑 智生膠囊Ⅰ號方由陜西中醫(yī)學院藥物研究所提供，制成混懸液含生藥1.2g／mL；健腦膠囊由江西廣信藥業(yè)有限公司，批準文號Z36020840，加入蒸餾水配制成濃度16.2mg／mL的混懸液；D－半乳糖注射液，西安阿爾寶生物技術有限責任公司，批號－0637；生理鹽水、蒸餾水，由陜西中醫(yī)學院生理教研室提供。單胺氧化酶試劑盒，批號20070911；β－淀粉樣蛋白試劑盒，批號20070809；谷胱甘肽過氧化酶試劑盒，批號20070906；均由南京建成生物工程研究所提供。
　　1.3　主要實驗儀器　Morris水迷宮(陜西中醫(yī)學院藥理實驗中心按李儀奎方法制作)、電子天平BSl24S(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn))、數(shù)顯恒溫水槽DK－8AD型(上海一恒科技有限公司生產(chǎn))、723型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司生產(chǎn))、KDC－40低速離心機(北京科大創(chuàng)新股份有限公司生產(chǎn))、超聲波細胞粉碎機JY92－Ⅱ(寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn))、玻璃勻漿器(陜西中醫(yī)學院免疫教研室提供)。
　　
　　2　實驗方法
　　
　　2.1　動物分組　60只SD大鼠給予標準飼料，自由飲水，適應性喂養(yǎng)7d后，隨機分為6組：A－正常對照組、B－模型組、C－健腦膠囊組、D－ZSJN小劑量組、E－ZSJN中劑量組、F－ZSJN大劑量組，每組各10只，分籠飼養(yǎng)。
　　2.2　造模方法　除正常對照組外，其余各組按文獻，采用腹腔注射0.5％D－半乳糖50mg／kg·d，連續(xù)6周。
　　2.3　給藥方法　造模20d后開始給藥(大鼠用量按文獻法折算)，小、中、大劑量組分別相當于成人用量的10倍、20倍、40倍。灌胃體積勻為每天3mL／只，中、小劑量組加蒸餾水稀釋，大劑量組水浴中加熱濃縮，3種劑量配置為等體積液體。A、B組每日給予等體積生理鹽水灌胃；C組給予健腦膠囊0.162g／kg(相當于臨床用量10倍)加蒸餾水配置為混懸液灌胃；D組每日給予ZSJN4g／kg(10倍于臨床用量)灌胃，E組每日給予ZSJN8g／kg(20倍于臨床用量)灌胃；F組每日給予ZSJNl6g／kg(40倍于臨床用量)灌胃；各給藥組連續(xù)給藥28d。
　　
　　3　指標觀察
　　
　　3.1　行為學指標Morris水迷宮法將該裝置由一不銹鋼制成的圓柱形水池和一可移動位置的圓柱形透明有機玻璃站臺組成。水池直徑120cm，高50cm，站臺直徑12cm，高24cm。水池水深25cm(高出站臺lcm)，水溫控制在(23±0.5)℃，在水池邊緣上等距離設有東南西北4個標記，將水池均等的分為4個象限。圓形水池中加入脫脂奶粉，使水渾不見低于水面1em的隱藏平臺，每天將大鼠面向池壁分別從東南西北4個不同象限固定入水池中各1次，直至找到并站在平臺上為止，游泳超過60S后，人為將大鼠放至平臺上10S進行訓練。每天的四周實物等固定，6天后正式實驗，將隱藏平臺的位置轉(zhuǎn)移到對面象限中，記錄爬上平臺潛伏期的時間。
　　3.2　試劑盒的測定　于記憶功能測定結束后第2d，用脫臼法處死動物，在冰臺上快速取出大鼠腦組織并置于冰生理鹽水中漂洗，除去血跡，濾紙拭干、稱重后，再將腦迅速浸入冷生理鹽水中(生理鹽水重量為腦組織重量的9倍)，用玻璃勻漿器在冰浴中制成10％的組織勻漿，以3000r／min離心10min，取勻漿上清液待用。對腦組織中的MA()、β－AP、GSH-Px的測定嚴格按照試劑盒說明書進行。同時快速送一部分腦勻漿至附院同位素室檢測β－AP含量。
　　
　　4　統(tǒng)計方法
　　
　　數(shù)據(jù)均采用均數(shù)加減標準差表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理(2組間以t檢驗比較差異的顯著性；多組間以單因素方差分析進行假設檢驗，多重比較采用Dunnett t檢驗、q檢驗。)
　　
　　5　實驗結果
　　
　　5.1　各組大鼠在Moriss水迷宮實驗中的檢測結果見表1。
　　
　　從表1中可以看出：與正常組相比，模型組所用時間明顯增多(P＜0.01)，造模成功；與模型組相比，各治療組所用時間減少(##P＜0.01，#P＜0.05)，治療有效；各治療組相比，中劑量組效果最佳(△P＜0.01)。
　　5.2　智生膠囊Ⅰ號方對AD模型大鼠腦組織MA()、β－AP、GSH-Px酶含量的影響　結果見表2。
　　從表2可以看出：對于MAO活性，與正常組相比，模型大鼠腦組織MAO的含量明顯升高(P＜0.01)，說明造模成功；與模型組相比，各治療組MA()的含量不同程度降低(##P＜0.01，#P＜0.05)，治療有效；各治療組間相比，中劑量組效果最佳(△△P＜0.01)，且健腦膠囊與大劑量組無差異。對于p—AP含量，與正常組相比，模型組大鼠腦組織β－AP含量明顯升高(*P＜0.01)，說明造模成功；與模型組相比，各治療組β－AP含量不同程度降低(##P＜0.01，#P＜0.05)，治療有效；各治療組間相比，中劑量組效果最佳(△△P＜0.01)。且健腦膠囊與大劑量組無差異性。對于GSH-Px活性，與正常組相比，造模組大鼠腦組織GSH-Px含量明顯降低(*P＜0.01)，造模成功；與模型組相比，各治療組GSH-Px含量不同程度的升高(##P＜0.01，#P＜0.05)，治療有效；各治療組間相比，中劑量組效果最佳(△△P＜0.01)，且健腦膠囊與大劑量組無差異性。提示健腦膠囊及智生膠囊Ⅰ號方對AD的治療作用是通過降低MA()、β－AP活性。提高GSH-Px活性來實現(xiàn)的。
　　
　　6　討論
　　
　　現(xiàn)代醫(yī)學表明單胺氧化酶是體內(nèi)參與胺類物質(zhì)代謝的主要酶類，其代謝底物主要為單胺類和兒茶酚胺類物質(zhì)。MA()活性隨年齡增高而加強，與年齡程正相關，被認為是老化的標志，可間接反映人體的老化程度，又稱為老化相關酶。單胺類遞質(zhì)如去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(Adr)、多巴胺(DA)、5－羥色胺(5－HT)等，與學習和記憶的關系極為密切嘲。MA()單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的降解酶，AD患者組織中MA()活性升高，氧化分解單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，促進神經(jīng)系統(tǒng)老化。Hei－nonen報道使用單胺氧化酶抑制劑(MAOI)Selegiline治療老年性癡呆有效。同時有關學習記憶障礙研究顯示Ahhcim－crs病(AD)在病理學上的特征性改變是發(fā)生神經(jīng)炎斑(老年斑SP)形式的淀粉樣沉淀以及神經(jīng)纖維纏(NFT)。近年來大量研究表明，β－AP是構成SP的核心物質(zhì)。現(xiàn)有的大量實驗結果和臨床資料表明，β－AP是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD形成和發(fā)展的關鍵因素。以往大量體內(nèi)外研究均證實β－AP，尤其是聚合成纖維形的β－AP對神經(jīng)元有毒性作用，表現(xiàn)在破壞細胞膜的完整性，擾亂細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定誘導細胞發(fā)生凋亡等方面。GSH-Px是機體抗氧化防御體系中重要的酶之一，能清除HO防止細胞脂質(zhì)過氧化，延緩生命衰老。GSH-Px在細胞內(nèi)主要位于線粒體和胞漿，據(jù)研究大鼠的大腦皮質(zhì)，海馬和小腦的神經(jīng)元中GSH-Px的含量較高、活性也較強。膠質(zhì)細胞的GSH-Px比在神經(jīng)元的活性強10倍。GSH-Px的主要作用機制是清除氧代謝產(chǎn)物和維持谷胱甘肽活性。谷胱甘肽(GSH)系統(tǒng)是細胞內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，尤其對細胞抵抗自由基的侵害起重要作用。因此測定GSH-Px的活性對于了解體內(nèi)抗氧化狀態(tài)，研究抗AD藥物有著重要的意義。
　　中醫(yī)學認為老年癡呆的發(fā)生主要是虛、痰、瘀三個方面，本虛為腎精虧虛、心脾不足、氣血虛損；標實為痰濁上擾、瘀血阻竅。病位在心腦，與肝脾腎關系密切，痰濁瘀血為基本病理因素。智生膠囊Ⅰ號方以補腎填精、益氣活血、化痰祛瘀開竅為立法組方。方中君藥為人參、熟地、菟絲子等，氣血雙補，陰陽兼顧，動靜結合；臣藥為菖蒲、遠志寧心安神，祛痰開竅，兩藥和用，相輔相助，使氣血不復上苑，痰濁消散不蒙清竅，神志自可清明，川芎有活血行氣開郁，祛風止痛之功，為血中氣藥，且能上行頭目。銀杏葉為佐使藥，功能斂肺止咳，活血止痛，健腦益智。全方邪正兼顧，標本同治，共奏健腦益智強記之功。
　　智生膠囊Ⅰ號方可明顯降低D-半乳糖模型大鼠腦組織MAO活性和β-AP含量、提高腦組織GSH-Px含量，使腦內(nèi)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)水平升高，增強了遞質(zhì)的傳遞，清除過多的氧自由基，拈抗了記憶障礙，改善記憶功能，是該藥發(fā)揮益智作用的重要途徑和主要機理之一，同時此作用的發(fā)揮可能是以益氣補血填精功用為基礎。藥理實驗中大劑量組綜合評價效果不如中劑量組，可能是因為大劑量組濃度較大，灌胃后吸收差的原因造成的，需要更為詳盡的藥理實驗進一步探索其量效關