白芷黑斑病病原菌鑒定及病害發(fā)生規(guī)律研究

喻　霜　葉華智　嚴(yán)吉明

摘要對(duì)四川白芷黑斑病的癥狀、病原菌致病性和形態(tài)特征等進(jìn)行了研究，確定病原菌為當(dāng)歸葉點(diǎn)霉(Phyllostictaangelicae Saccardo)。經(jīng)兩年的田間病害發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查，該病在四川始發(fā)期為3月上旬，高峰期為6月份，病株率達(dá)100％，病葉率達(dá)74.51％。病害的初侵染源主要是留種株的病葉和田間病殘?bào)w。病菌分生孢子借雨滴飛濺的方式傳播，并在白芷生長(zhǎng)期中不斷引起再侵染。

關(guān)鍵詞白芷；白芷黑斑病；當(dāng)歸葉點(diǎn)霉；發(fā)生規(guī)律

中圖分類號(hào)S 435.672

白芷(Angelica dahurica)為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，屬傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物，以根入藥，同時(shí)也是一種香料和調(diào)味輔料。川白芷為川產(chǎn)地道藥材，主產(chǎn)于四川遂寧，其產(chǎn)量約占全國(guó)商品白芷總產(chǎn)量的70％。近年來(lái)，在四川遂寧等白芷種植區(qū)普遍發(fā)生了一種新病害——白芷黑斑病，該病蔓延迅速，病情嚴(yán)重，導(dǎo)致葉片枯死，植株早衰，已經(jīng)成為產(chǎn)區(qū)白芷的主要病害之一。迄今未見(jiàn)有白芷黑斑病的研究和報(bào)道。為了明確引起該病的病原、掌握病害田間發(fā)生發(fā)展規(guī)律，筆者對(duì)白芷黑斑病進(jìn)行了病原菌的分離鑒定和致病性測(cè)定，同時(shí)于2006—2007年連續(xù)兩年調(diào)查了該病的田間發(fā)生動(dòng)態(tài)和病害循環(huán)。

1材料與方法

1．1病原菌的分離與鑒定

1．1．1癥狀觀察

在四川省遂寧市白芷生產(chǎn)基地采集病害樣本進(jìn)行觀察，紀(jì)錄病害癥狀。

1．1．2病原菌的分離和致病性測(cè)定

采集有黑斑病癥狀的白芷病葉，按常規(guī)組織分離后再經(jīng)單孢純化培養(yǎng)，獲得菌株。用無(wú)菌水配制孢子懸浮液，對(duì)白芷健株進(jìn)行噴霧接種，塑料袋保濕48 h，發(fā)病后觀察癥狀特征并再次分離鑒定病原菌，完成柯赫氏法則檢驗(yàn)。

1．1．3病原菌的種類鑒定

分別對(duì)病斑上的病原菌子實(shí)體和致病性測(cè)定的分離菌的培養(yǎng)性狀、分生孢子器及分生孢子的形態(tài)大小進(jìn)行測(cè)定，并按照真菌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行種類鑒定。

1．2病害發(fā)生規(guī)律研究

1．2．1病害田間發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查

白芷是跨年收獲的藥材，在當(dāng)年9月中旬至10月上旬播種，次年的7月底至8月中旬收獲。田間病害發(fā)生動(dòng)態(tài)的調(diào)查時(shí)間為2006年2～7月和2006年11月至2007年6月兩個(gè)白芷生長(zhǎng)季，調(diào)查地點(diǎn)在四川遂寧白芷生產(chǎn)基地。選取2處田塊作為定點(diǎn)調(diào)查地，采用五點(diǎn)法，取對(duì)角線上的5點(diǎn)，定點(diǎn)定株調(diào)查，每隔15天左右調(diào)查1次病害的發(fā)病率及嚴(yán)重度(按5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn))，并計(jì)算病情指數(shù)。此外，還在田間大范圍觀察白芷黑斑病的發(fā)病情況。病葉嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下。

0級(jí)：整葉無(wú)病斑；

1級(jí)：病斑面積占全葉面積＜1/4；

2級(jí)：病斑面積占全葉面積的1/4～1/2；

3級(jí)：病斑面積占全葉面積的1/2～3/4；

4級(jí)：病斑面積占全葉面積＞3/4。

1．2．2病原菌存活力的測(cè)定

2006年7月從田間采集病葉，風(fēng)干后保存于室內(nèi)。定期剪取病斑，置于無(wú)菌水中使分生孢子器內(nèi)的分生孢子釋放出制成孢子懸液，采用玻片萌發(fā)法，在20℃下，48 h后觀察分生孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子的存活率；同時(shí)取病斑病健交界處，用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離，測(cè)定菌絲體在病組織內(nèi)的存活時(shí)間，為了解病菌的越冬越夏提供一定依據(jù)。

1．2．3留種株上病原菌越冬越夏的調(diào)查

白芷采用種子繁殖，一般在7月挖收白芷時(shí)選取植株栽植，次年6～7月開(kāi)花結(jié)實(shí)收取種子。因此留種株上是否有黑斑病發(fā)生，是掌握病菌越冬越夏場(chǎng)所的重要方面，為此，對(duì)留種株上的黑斑病發(fā)生情況進(jìn)行了田間調(diào)查觀察。

2結(jié)果與分析

2．1病害癥狀

白芷黑斑病主要危害葉片，亦可危害葉柄和莖(圖1)。葉部發(fā)病初期呈現(xiàn)水浸狀小斑點(diǎn)，逐漸擴(kuò)展為近圓形或不規(guī)則形的暗褐色病斑，直徑3～15 mm，后期病斑中部顏色變淺，邊緣仍保持暗褐色；病斑表面散生小黑點(diǎn)(分生孢子器)，病健交界處有時(shí)會(huì)出現(xiàn)褪綠黃色圈。植株成葉發(fā)病較重，幼嫩新葉發(fā)病較輕。葉柄和莖上的病斑為長(zhǎng)條形暗褐色，稍凹陷。

2．2柯赫氏法則驗(yàn)證

用分生孢子懸浮液噴霧接種白芷葉片，6～8 d后出現(xiàn)水浸狀小點(diǎn)，15 d左右形成暗褐色典型病斑，與田間自然發(fā)病癥狀相似。對(duì)病菌進(jìn)行組織分離，獲得了相同病原菌，證明該菌是白芷黑斑病的致病菌。

2．3病原菌種類鑒定

病原菌的分生孢子器葉面生，多為散生，球形、扁球形，直徑70～135 μm，器壁褐色至暗褐色，初埋生后突破表皮，孔口外露，圓形，周?chē)?xì)胞顏色較深。分生孢子單胞，無(wú)色，橢圓形，具有1個(gè)油球，大小(3.3～5.0)μm×(1.7～2.2)μm，有黏液，孢子不易分散(圖2)。葉片上的分生孢子器遇水或有露滴時(shí)釋放出分生孢子，有時(shí)在孔口聚集成淡黃色黏質(zhì)團(tuán)。

在PDA培養(yǎng)基上，病菌菌落圓形平鋪，短絨狀，初為灰白色，后期轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚痪z無(wú)色或淡褐色，有分隔；分生孢子器初為黃褐色，成熟后為黑色小點(diǎn)，當(dāng)濕度很高時(shí)從孔口中溢出分生孢子，聚集形成奶油色的分生孢子團(tuán)；分生孢子器直徑為65～130μm，分生孢子大小為(2.8～4.5)μm×(1.8～2.0)μm，兩者在形態(tài)和大小方面都與植物組織上觀察到的相近。

參照有關(guān)資料，確定川白芷黑斑病的病原菌為半知菌亞門(mén)葉點(diǎn)霉屬的當(dāng)歸葉點(diǎn)霉(Phyllos—ticta angelicae Saccardo)。

2．4病害田間發(fā)生動(dòng)態(tài)研究

白芷黑斑病在田間的一般發(fā)生發(fā)展情況是：田間最早出現(xiàn)的病株多在白芷留種田附近以及連作地內(nèi)；病害最早發(fā)生在植株下部葉片，逐漸向植株上部葉片及鄰近植株擴(kuò)展，發(fā)病初期有明顯的中心病團(tuán)。

2006—2007年對(duì)白芷黑斑病兩個(gè)生長(zhǎng)季的田間發(fā)生動(dòng)態(tài)調(diào)查結(jié)果見(jiàn)圖3、4：在白芷秋播的幼苗上未發(fā)現(xiàn)黑斑病；病害始發(fā)期2006年為4月15日、2007年為4月1日，其病株率、病葉率分別為10.50％、3.52％和12.50％、5.85％。2006年4月底至5月中旬病害發(fā)展迅速，5月15日病株率和病葉率達(dá)88.50％和41.32％；2007年春為暖春，病害的發(fā)生和發(fā)展較2006年同期更早更快，在4月期間病情急劇發(fā)展，5月1日病株率、病葉率分別升至80.00％和39.15％。2006年病害高峰期為6月15日，病葉率達(dá)66.05％，到7月1日病情指數(shù)為35.25；2007年6月1日病害進(jìn)入高峰期，病葉率升至最高74.51％，6月20日病株率高達(dá)100％，病情指數(shù)為37.04。至此，白芷進(jìn)入了生育后期，葉片普遍出現(xiàn)生理性變黃枯萎，病情發(fā)展基本停止。

通過(guò)田間大范圍的發(fā)病觀察，該病始發(fā)期2006年為3月13日、2007年為3月1日，病害的消長(zhǎng)情

況與定點(diǎn)調(diào)查結(jié)果基本一致。

2．5病原菌存活力的測(cè)定

2．5．1分生孢子存活力測(cè)定

對(duì)病葉上病菌分生孢子的萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果表明(圖5)：從2006年7月采回病葉到11月1日，分生孢子的萌發(fā)率為80.33％。以后隨時(shí)間延長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率逐漸下降，到2007年4月15日，孢子的萌發(fā)率仍有4.21％。

2．5．2病葉中菌絲體的存活測(cè)定

用組織分離法，自120 d起不能再?gòu)牟∪~標(biāo)本里分離出病原菌，說(shuō)明菌絲體在室溫下在病組織內(nèi)的存活時(shí)間約為4個(gè)月。

2．6田間留種株上的病害觀察

7月下旬至8月中旬生產(chǎn)上栽植留種株，8月下旬留種株葉片上見(jiàn)有黑斑病發(fā)生，并在其上緩慢擴(kuò)展；11月份進(jìn)入冬季，病害基本停止發(fā)展；直至次年的春季氣溫回升后，病害又繼續(xù)在留種株上蔓延。

2．7不同白芷品種上的發(fā)病情況

2007年在田間病害基本穩(wěn)定時(shí)(6月中旬)，在遂寧白芷生產(chǎn)基地品比試驗(yàn)田中對(duì)不同品種白芷上黑斑病的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果說(shuō)明在發(fā)病的嚴(yán)重程度上各品種之間存在一定差異(表1)。

3結(jié)論與討論

白芷黑斑病為四川白芷上的一種新病害，雖然近年在種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，但至今尚未見(jiàn)有對(duì)該病害的研究報(bào)道。病原菌的鑒定是研究病害的一個(gè)重要基礎(chǔ)性環(huán)節(jié)。文獻(xiàn)中僅有于莉等1994年在東北興安白芷葉片上發(fā)現(xiàn)了一種葉點(diǎn)霉寄生菌一當(dāng)歸葉點(diǎn)霉(Phyllosticta angelicae Saccardo)；此后陳小紅等報(bào)道四川白芷的黑斑病病原菌為Phyllostic-ta sp.。筆者在此基礎(chǔ)上對(duì)四川白芷上的黑斑病進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，確定引起川白芷黑斑病的病原菌為半知菌亞門(mén)葉點(diǎn)霉屬的當(dāng)歸葉點(diǎn)霉。

研究病害的田間發(fā)生動(dòng)態(tài)，對(duì)了解病害的發(fā)生規(guī)律和防治有重要的理論和實(shí)踐意義。四川遂寧屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，全年氣溫溫和，降雨充沛，日照充足，適宜白芷黑斑病的發(fā)生和發(fā)展。隨著近幾年種植面積的擴(kuò)大和集約化栽培，該病在當(dāng)?shù)匚：χ鹉昙又亍＞C合2006—2007年對(duì)白芷黑斑病田間發(fā)生動(dòng)態(tài)的研究，結(jié)論是：該病始發(fā)期為3月上旬；4月至5月上旬主要向周?chē)仓晁綌U(kuò)展，病株率增長(zhǎng)較快；5月中旬至6月中旬主要向植株上部葉片垂直擴(kuò)展，病情指數(shù)明顯升高，高峰期為6月份。由于黑斑病菌的分生孢子在分生孢子器內(nèi)，當(dāng)高濕或遇水露時(shí)才釋放出分生孢子，因此病菌主要靠雨滴飛濺的方式傳播；加上病菌產(chǎn)孢量大、致病性強(qiáng)，在生長(zhǎng)季不斷引起再侵染，白芷葉片大而平展、密集，皆易于該病害的傳播和流行。

對(duì)病原菌分生孢子和病組織中菌絲體存活力的測(cè)定，以及田間留種株上黑斑病的發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果表明：病原菌主要以菌絲體和分生孢子器在田間病殘?bào)w和留種株上越夏越冬，以分生孢子作為初侵染來(lái)源。因此做好秋季田間病殘?bào)w的清理，并及時(shí)摘除留種株上的病葉和藥劑防治，可有效減少病害初侵染源。