ＨＰＰＤ抑制劑的機(jī)理與應(yīng)用進(jìn)展

趙李霞　葉　非

摘要：HPPD是在植物光合作用過程中發(fā)現(xiàn)的一類新型除草劑靶標(biāo)酶，可以催化對(duì)羥苯基丙酮酸氧化脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚝谒帷PPD抑制劑的抑制作用會(huì)導(dǎo)致植物分生組織產(chǎn)生白化癥狀，最終死亡。本文對(duì)HPPD的作用機(jī)理以及HPPD抑制劑主要品種的應(yīng)用作了綜述。

關(guān)鍵詞：HPPD；除草劑；抑制劑

中圖分類號(hào)：S 482．4

對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶(HPPD)是20世紀(jì)90年代確定的除草劑作用靶標(biāo)酶。該酶抑制劑具有廣譜的除草活性，能同時(shí)防除闊葉作物中的闊葉雜草，可以在芽前使用，也可以在苗后使用，具有活性高、殘留低、環(huán)境相容性好、使用安全的特點(diǎn)。以HPPD作為靶標(biāo)已開發(fā)出若干不同結(jié)構(gòu)類型的高活性除草劑，包括毗唑類、三酮類、異嗯唑類、二酮腈類和二苯酮類化合物。這些除草劑在分子結(jié)構(gòu)上具有如下特點(diǎn)：(1)含有一個(gè)三羰基甲烷結(jié)構(gòu)單元，其中一個(gè)羰基必須和取代苯環(huán)直接相連。(2)化合物能夠烯醇化以保證它具有與對(duì)羥基苯基丙酮酸(HPP)競(jìng)爭(zhēng)HPPD活性中心Feu²⁺進(jìn)行絡(luò)合的能力。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其抗性的報(bào)道，因此，這是一類有發(fā)展前景的需光型除草劑。本文對(duì)HPPD抑制劑主要品種的作用機(jī)理以及應(yīng)用作了詳細(xì)綜述。

1HPPD的作用機(jī)理

自20世紀(jì)初HPPD酶被發(fā)現(xiàn)以來，在微生物、哺乳動(dòng)物和植物中都找到了HPPD，但在不同的生物體內(nèi)作用機(jī)制不同。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，HPPD酶對(duì)于酪氨酸的分解代謝有很重要的作用；在植物體內(nèi)HPPD酶催化質(zhì)體醌與生育酚生物合成的起始反應(yīng)。Yang C從擬南芥中提取到除草劑目標(biāo)酶HPPD的晶體結(jié)構(gòu)，確定了它有多個(gè)開放的扭曲混合筒形面，外面有螺旋環(huán)繞。擬南芥。HPPD結(jié)構(gòu)中的金屬離子與His205、His287、Glu373和3個(gè)水分子配位組成一個(gè)八面體復(fù)合物，活性位點(diǎn)位于其中一個(gè)開放的扭曲混合筒形面，催化中心的金屬離子是Fe²⁺。非選擇性抑制劑結(jié)合的哺乳動(dòng)物(小鼠)的HPPD結(jié)構(gòu)與擬南芥HPPD總體很相似，但小鼠的HPPD酶在c-端螺旋之前有一個(gè)短的剛性環(huán)，這可能直接限制了螺旋的靈活性以及可能的取向。在約1 000個(gè)HPPD抑制劑中篩查發(fā)現(xiàn)了6個(gè)高植物選擇性的抑制劑，它們?cè)贑₃結(jié)構(gòu)上有一個(gè)苯基取代或在吡唑環(huán)的N1結(jié)構(gòu)上有一個(gè)叔丁基取代；而有些結(jié)構(gòu)具備了這兩者的共性。對(duì)于植物和哺乳動(dòng)物HPPD-配位結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)比較獲得的特定HPPD抑制劑高植物選擇性的結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)，為設(shè)計(jì)有效的植物HPPD抑制劑提供了指導(dǎo)。

HPPD酶是一種鐵一酪氨酸蛋白，它在各種有機(jī)體中催化植物體內(nèi)質(zhì)體醌與生育酚生物合成的起始反應(yīng)，即催化對(duì)羥苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化為尿黑酸的過程，同時(shí)釋放出CO₂。HPPD酶的催化活性受酸度、溫度、還原劑以及植物細(xì)胞溶液的影響。研究認(rèn)為在催化反應(yīng)的第一步(圖1)，對(duì)羥苯基丙酮酸利用其a-酮酸部分在氧氣輔助下與HPPD酶鍵合生成絡(luò)合物；然后對(duì)羥苯基丙酮酸中雙氧被活化，三元的酶一底物-雙氧配體首先對(duì)鐵(Ⅱ)-過酸中間體脫羧放出CO₂得到化合物A；化合物A的O-O鍵異裂得到鐵(Ⅳ)-氧絡(luò)合的化合物B，化合物B反應(yīng)活性很高，它進(jìn)攻苯環(huán)產(chǎn)生一個(gè)由Fe-C鍵組成的四元環(huán)并發(fā)生重排成為芳烴氧化物中間體c；隨后中間體c打開，環(huán)氧化物環(huán)組成陽離子σ復(fù)合物D；復(fù)合物D中的乙酸結(jié)構(gòu)從苯環(huán)的c¹側(cè)鏈遷移到C²轉(zhuǎn)化為酮中間體E；最后酮中間體再次芳香化得到終產(chǎn)物尿黑酸。此外，還有一種機(jī)理認(rèn)為，鐵(Ⅳ)-氧絡(luò)合的化合物B作為親電基團(tuán)攻擊了苯環(huán)的C¹碳原子，然后可以直接組成陽離子σ復(fù)合物D。研究發(fā)現(xiàn)芳香氧化物的形成和催化活性之間沒有關(guān)聯(lián)性。

對(duì)羥基苯基丙酮酸在HPPD酶催化條件下轉(zhuǎn)化得到的尿黑酸是植物體內(nèi)一種重要物質(zhì)。它可以進(jìn)一步脫羧、聚戊二烯基化和烷基化，從而生成質(zhì)體醌和生育酚。HPPD酶抑制劑的抑制結(jié)果是植物體內(nèi)質(zhì)體醌和生育酚的減少，引起植物白化癥狀。為了確定改變HPPD活性能夠影響生育酚含量，Yoseph在轉(zhuǎn)基因作物擬南芥中過量表達(dá)了HPPD，得到的轉(zhuǎn)基因作物對(duì)HPPD抑制劑除草劑磺草酮的抗性增加，證明該作物HPPD活性很高。通過核糖核酸的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系中HPPD的蛋白質(zhì)含量和活性水平比野生植物要高10倍；對(duì)葉子和種子材料的生育酚含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：葉子中生育酚含量升高了37％，種子中生育酚含量升高了28％。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：HPPD活性或者尿黑酸含量能夠影響光合作用和非光合作用植物細(xì)胞中生育酚的生成。FalkJ等利用HPPD活性提高植物中生育酚的含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：得到的轉(zhuǎn)基因株系種子中的生育酚含量比普通株系高兩倍，而葉子中的生育酚含量沒有受到影響。HPPD活性能夠影響植物細(xì)胞中生育酚的生成；同時(shí)，HPPD抑制劑除草劑的潛力激發(fā)了人們發(fā)展高抗性轉(zhuǎn)基因作物的興趣。

2主要的靶標(biāo)HPPD除草劑品種及其應(yīng)用

早在1985年人們就發(fā)現(xiàn)HPPD有可能成為除草劑新品種的新靶標(biāo)。到目前為止，除了吡唑類品種外，新近又有一些廣譜、高活性新品種被開發(fā)出來，包括三酮類的磺草酮(sulcotrlone)、甲基磺草酮(mesotrione)和雙環(huán)磺草酮(benzobicylon)以及異嗯唑類的異嗯唑草酮(isoxaflutole，百農(nóng)思)以及后來發(fā)現(xiàn)的二酮腈類和二苯酮類化合物。2002年G.Meazza研究了34種不同結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物對(duì)HPPD的抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥的重組細(xì)胞HPPD對(duì)很多種天然化合物很敏感，它們包含：三酮類，苯醌類，萘醌類和蒽醌類。這些物質(zhì)不同的動(dòng)力學(xué)行為提供了新型HPPD抑制劑結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的發(fā)展方向。

2.1三酮類除草劑

三酮類除草劑是由捷利康公司開發(fā)的一類HP-PD抑制劑，目前已有3個(gè)品種開發(fā)成功，它們是磺草酮、甲基磺草酮和雙環(huán)磺草酮。磺草酮是商業(yè)化開發(fā)的第1個(gè)三酮類除草劑品種，在歐洲各國(guó)廣泛使用，也是我國(guó)農(nóng)藥企業(yè)關(guān)注的一個(gè)品種。與傳統(tǒng)的玉米田除草劑相比，磺草酮環(huán)境相容性好，可有效地防除多種闊葉雜草和禾本科雜草。磺草酮的開發(fā)和商品化具有深遠(yuǎn)意義及廣闊開發(fā)前景。J.S.Kim的研究表明除草劑磺草酮不同程度上降低了植物中葉綠素和類胡蘿卜素含量。磺草酮的主要除草劑作用是通過減少作物中的質(zhì)體醌含量來抑制成熟的綠色組織中電子的轉(zhuǎn)移來達(dá)到的。研究結(jié)果表明，玉米對(duì)磺草酮的耐藥性是由于玉米對(duì)藥劑的吸收速度緩慢所造成；玉米體內(nèi)HPPD的分子質(zhì)量為43 ku，其活性需有還原劑谷胱甘肽或二氯酚與抗壞血酸，當(dāng)存在抗壞血酸時(shí)，玉米體內(nèi)對(duì)羥苯基丙酮酸雙氧化酶的活性可提高2倍。玉米能通過P-

450催化的4-羥基化作用迅速將藥劑代謝為無活性產(chǎn)物。15％磺草酮水劑對(duì)玉米田雜草具有較好的防除效果，表現(xiàn)為殺草譜較廣，可有效防除馬唐、牛筋草、旱稗、小薊、鱧腸、鐵莧菜等多種單雙子葉雜草，但對(duì)馬齒莧無效。15％磺草酮水劑在玉米上使用，用藥時(shí)間掌握在玉米3～4葉期、雜草2～5葉期比較適宜。15％磺草酮水劑在玉米田使用比較安全，高劑量雖易造成玉米葉片邊緣發(fā)白，但5～7 d可恢復(fù)正常。

甲基磺草酮是通過磺草酮結(jié)構(gòu)修飾而開發(fā)的三酮類除草劑品種，其生物活性超過磺草酮10倍以上，主要用于防除玉米田雜草如蒼耳等，防除對(duì)磺酰脲除草劑產(chǎn)生抗性的雜草有效。2000年甲基磺草酮在歐洲登記，于2001年以商品名Callisto開始在德國(guó)與奧地利銷售。由于其對(duì)環(huán)境友好，2001年通過美國(guó)環(huán)境保護(hù)局的批準(zhǔn)，其單劑及混合制劑于2002年在歐盟各國(guó)與美國(guó)銷售。甲基磺草酮以其殺草譜廣、活性高、可混性強(qiáng)、對(duì)后茬作物安全、使用靈活、環(huán)境相容性強(qiáng)等特點(diǎn)在我國(guó)具有較大開發(fā)價(jià)值及較好的推廣使用前景。

雙環(huán)磺草酮是由日本SDS生物技術(shù)公司開發(fā)的白化型水稻田用苗后除草劑。該公司于1992年開始合成雙環(huán)磺草酮，1994年進(jìn)行田間試驗(yàn)，2001年獲得登記，并開發(fā)了多種混劑。該藥劑的殺草譜廣，能防除水田重要雜草，尤其是難以防除的具芒碎米莎草的螢藺類效果最為明顯。此外，它還具有處理時(shí)期寬和持效性長(zhǎng)的特點(diǎn)，并防除對(duì)磺酰脲類除草劑的抗性雜草也十分有效。目前，雙環(huán)磺草酮已經(jīng)有數(shù)十個(gè)不同混劑及配方，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。在日本雙環(huán)磺草酮已成為水稻田中主要應(yīng)用的除草劑，2001～2003年的使用達(dá)到70萬hm²，約為水稻田除草劑使用面積的24％。

三酮類除草劑的最大優(yōu)點(diǎn)是：(1)水溶液的貯存穩(wěn)定性強(qiáng)，不易揮發(fā)與光解；(2)與其他除草劑的相容性好，利于開發(fā)混合制劑；(3)弱酸性除草劑，便于植物吸收。D.L.Lee研究表明三酮類除草劑的除草活性受到苯環(huán)上取代基的影響，取代基不同不僅會(huì)影響到分子的酸度還會(huì)影響到對(duì)HPPD酶的吸引力。

2.2吡唑類除草劑

20世紀(jì)80年代初期，日本三共、三菱油化、石原產(chǎn)業(yè)公司分別開發(fā)成功3個(gè)吡唑類HPPD抑制劑除草劑：吡唑特(pyrazolate)、吡草酮(benzofenap)和芐草唑(pyrazoxyfen)。吡唑類除草劑能阻止植物體中的4-羥基苯基丙酮酸向尿黑酸的轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致無法合成質(zhì)體醌和生育酚，進(jìn)而間接抑制了類胡蘿卜素的生物合成，使植物產(chǎn)生白化癥狀，直至最終死亡。它們具有廣譜的除草活性，低殘留，與環(huán)境友好，安全性好，屬于苯基吡唑酮類化合物。吡唑特對(duì)稻、稗草具有選擇性而對(duì)某些多年生雜草如蘆葦、瓜皮草、莎草科雜草和其他水田闊葉雜草有很好的防除效果。經(jīng)田間試驗(yàn)，吡唑特于1980年在日本注冊(cè)，在稻田中使用，防除對(duì)磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗藥性的慈姑、雨久花等雜草有很好的控制作用。尤其是它能與多種除草劑配合使用，并具有增效作用，能達(dá)到單獨(dú)使用時(shí)所起不到的效果。在我國(guó)北方稻田中，吡唑特和丁草胺混用的綜合雜草防除效果比較理想。吡草酮具內(nèi)吸性，主要通過靶標(biāo)雜草的根和基部吸收，最終導(dǎo)致死亡，具有典型的吡唑類形態(tài)上的變化，如白化、黃化等，與稗草丹和溴丁酰草胺復(fù)配可防治水稻田一年生和多年生闊葉雜草。芐草唑通過雜草的幼莖和根吸收，并傳輸?shù)秸麄€(gè)植株，具有內(nèi)吸性。水稻移栽后，雜草芽前、芽后施藥，可防除一年生和多年生雜草，用量為有效成分3 kg／hm²，但旱田除草效果不好。

2004年，程永浩將吡唑環(huán)代替苯環(huán)與吡唑甲酰基相連，合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的、羰基鄰位帶有氨基的二吡唑酮類化合物，并測(cè)定了其除草活性。以5-氨基-1-甲基-3-取代-4-乙氧羰基吡唑?yàn)樵希c水合肼反應(yīng)，生成吡唑甲酰肼后，與取代烯酮二硫縮醛關(guān)環(huán)，合成了25個(gè)未見報(bào)道的新型吡唑甲酰基吡唑類化合物。用小杯法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了生物活性測(cè)定，結(jié)果顯示，該系列化合物有一定的除草活性。同系列化合物中，苯環(huán)上氟代化合物除草活性較高，說明電負(fù)性對(duì)活性影響很大。但是由于化合物在水和有機(jī)溶劑中的溶解度都很低的緣故，所設(shè)計(jì)的化合物活性不高。

2.3異噁類除草劑

異噁唑類除草劑目前有2個(gè)品種：異嗯唑草酮和異嗯氯草酮(isoxachlortole)。異噁唑草酮是一種選擇性內(nèi)吸型芽前除草劑，主要用于玉米、甘蔗等旱作物田防除苘麻、藜、地膚、豬毛菜、龍葵、反枝莧、柳葉刺蓼、鬼針草、馬齒莧、繁縷、香薷、蒼耳、鐵莧菜、水棘針、酸模葉蓼、婆婆納等多種一年生闊葉雜草，對(duì)馬唐、稗草、牛筋草、千金子、大狗尾草和狗尾草等一些一年生禾本科雜草也有較好的防效，但是不能作為大豆田除草劑使用。異噁唑草酮水分散粒劑對(duì)玉米田禾本科雜草和闊葉雜草均有良好的防除效果，對(duì)闊葉雜草防除效果好于禾本科。異嗯唑草酮與乙草胺混用可以降低前者的用藥量，還能提高對(duì)禾本科雜草的防除效果。雖然各劑量處理區(qū)對(duì)玉米幼苗有藥害，但是恢復(fù)較好，對(duì)玉米產(chǎn)量沒有影響。玉米播后芽前土壤處理，異噁唑草酮單用時(shí)適宜的用藥量為180 g／hm²，混加50％乙草胺乳油時(shí)適宜的用藥量為120～150 g／hm²。在大豆田中使用時(shí)，75％異嗯唑草酮水分散粒劑播后芽前土壤處理，異嗯唑草酮播后苗前土壤處理，大豆能正常出苗。第1片復(fù)葉期后有降雨，初期藥害癥狀為第1復(fù)葉變黃，并有銹色斑，心葉自葉邊緣向內(nèi)變黃至近白色，繼而邊緣干枯、脫落，形成缺刻，老葉嚴(yán)重黃化。新生復(fù)葉的邊緣褐色，向內(nèi)變黃，葉片很小，植株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。以后再出的心葉雖然綠色但極小。最終植株有50％莖葉枯死，殘存植株極瘦弱，能開花結(jié)實(shí)，但莢很少，不能恢復(fù)正常生長(zhǎng)。異唑草酮在國(guó)外使用也很廣泛，2005年美國(guó)玉米田用異噁唑草酮的處理面積達(dá)到6％，用量共計(jì)233千噸。2007年拜耳公司將異嗯唑草酮和氟噻草胺的混劑引入英國(guó)市場(chǎng)。異嗯氯草酮于1998年開始推廣應(yīng)用，但使用范圍不是很廣。

二酮腈類結(jié)構(gòu)是異嗯唑類除草劑活性成分的代謝物。羅納普朗克公司、巴斯夫公司和日本出光興產(chǎn)公司分別合成了二酮腈類化合物，都表現(xiàn)出了很好的除草活性。圖2是幾個(gè)二酮腈類化合物結(jié)構(gòu)。

二苯酮類化合物目前報(bào)道較少。捷利康公司和羅納普朗克公司分別合成了二苯酮類除草劑(圖3)，它們?cè)谝欢▌┝肯驴煞莱喾N雜草，但是還沒有推廣使用。

3展望

進(jìn)入21世紀(jì)，人類需要對(duì)環(huán)境友好的農(nóng)藥。未來除草劑的研發(fā)將嚴(yán)格受到環(huán)境和生態(tài)的制約，向著多元化、高層次的方向發(fā)展。追求安全性高、生物活性高、選擇性好的新型農(nóng)藥。這將是人類對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)品的更高要求，其最終目的是保護(hù)人類自身賴以生存的環(huán)境。HPPD抑制劑除草劑是一類很有前途的除草劑。其活性高、殘留低、環(huán)境相容性好、使用安全的特點(diǎn)符合人類對(duì)于新型除草劑的要求。未來的HPPD抑制劑除草劑研制將有以下發(fā)展趨勢(shì)：(1)向著高效、易降解的方向發(fā)展；(2)基于對(duì)HPPD抑制劑除草劑結(jié)構(gòu)與活性的研究成果，新型除草劑問世的速度將加快、成本將降低；(3)為了擴(kuò)大殺草譜、提高安全性，開發(fā)新的混劑和助劑將成為新的研究方向。