蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白Ｖｉｐｓ研究進展

申建茹　郭　巍

摘要：蘇云金芽孢桿菌Bt營養期殺蟲蛋白Vips主要分為Vip1、Vip2和Vip3 3種。Vip1和Vip2構成二元毒素，對葉甲科昆蟲具有特異殺蟲活性。Vip3對鱗翅目昆蟲具有廣譜殺蟲活性，該蛋白廣泛存在于Bt中，與已知殺蟲晶體蛋白ICPs沒有序列相似性。Vip3通過誘發細胞凋亡，最終導致昆蟲死亡，這與Bt δ-內毒素的作用機理完全不同，Vips的發現對于Bt的進一步開發利用具有重要意義。本文主要對營養期殺蟲蛋白Vips的分布、特性、作用機制及應用等進行報道。

關鍵詞：營養期殺蟲蛋白；二元毒素；Vip3A；蛋白特性；作用機制

中圖分類號：S 476．11

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在芽孢形成期產生的殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystal proteins，ICPs)是殺蟲的主要活性成分，ICPs通過作用于昆蟲中腸而導致昆蟲死亡[i-33。由于ICPs對鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleopter-a)、雙翅目(Diptera)等多種重要的農林業害蟲均具毒殺作用，Bt已成為目前研究最深入、應用最廣的殺蟲微生物。但是，在實際應用中仍有許多重要農作物害蟲對ICPs低敏感或不敏感，并且由于大規模和連續使用Bt，一些種群對Bt制劑產生了不同程度的抗性。因此，尋找具有與ICPs不同殺蟲作用方式的蛋白以延緩抗性產生具有深遠的意義。

Estrueh和Warren等人于1996年和1998年分別從B。thuringiensis菌株AB88和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)菌株AB78上清液中發現了新型分泌殺蟲蛋白，即營養期殺蟲蛋白(vegetative insecti-cidal proteins，Vips)，該類蛋白從對數生長中期開始分泌，直到穩定前期達到最高峰，具有熱不穩定性，95℃處理20 min便失活；一般不形成伴孢晶體且與已知的ICPs沒有序列相似性，最重要的是其殺蟲作用機理與ICPs不同。該蛋白的發現使Bt在殺蟲活性、殺蟲范圍方面得到很大突破，在一定程度上克服了多種害蟲對ICPs低敏感或不敏感的弊端。可見，Vips是一個極為豐富而且具有巨大潛力的資源，該領域已成為Bt研究的熱點。

Vips主要分為Vipl、Vip2和Vip3 3種。最近，Bt蛋白命名委員會提出按照Bt Cry毒蛋白的分類命名方法，將所有的Vip蛋白和類Vip毒素蛋白分為3個種、8個亞種以及更下一級的分類。

1Vip1／Vip2

對于vip1A／vip2A的研究較少，目前GenBank已收錄的全長vip1A／vip2A基因主要有4種。

1.1vip1A／2A基因的分布及Vip1A／Vip2A的殺蟲活性

Warren等人認為vip1A／vip2A基因在芽孢桿菌中分布較廣，約為11.9％。作者對本實驗室分離并保存的171株野生型Bt菌株進行PCR檢測，得到20株含有vip1A／vip2A基因的菌株，檢出率為11.69％(申建茹，郭巍，待發表)，與Warren等人的研究結果一致，而師永霞等人得出的檢出率僅為2％。

vip2A基因正位于vip1A基因的上游，兩基因的ORF(open reading frame)之間僅相差4個堿基。對viplA(a)／vip2A(a)基因的亞克隆和移碼突變分析表明，兩者的表達產物構成二元毒素，對玉米幼芽根葉甲等葉甲科昆蟲具有特異性，但對鱗翅目昆蟲無效。

1.2Vip1A／Vip2A蛋白的特性及其作用機理

Blast結果表明，ViplA蛋白N-端氨基酸序列相似性明顯高于C-端，Vip2A蛋白的C-端氨基酸序列相似性明顯高于N-端。而且Vip2A蛋白的保守性較高。

Vip1A(a)分子量為100 ku，分泌到胞外時，N-端1～33位氨基酸信號肽被切除，加工成約為80 ku的蛋白質。ViplA(a)與炭疽桿菌(Bacillus anthra-cis)的主要毒素成分即保護性抗原(protective antigen，PA)具有氨基酸序列相似性，PA可以將有活性的酶分子轉位到宿主細胞中。Vip2A(a)的信號肽位于其N-端1～49位氨基酸，其N-端還存在LKID-KVEDF(53～66)，因此在成熟蛋白質中信號肽已被切除。Vip2A(a)蛋白與一些具有ADP核糖轉移酶活性的二元毒素的酶活成分具有序列相似性，因此Vip2蛋白也代表了一種肌動蛋白-ADP核糖基化毒素的家族。Vip2蛋白的酶結構區域是一種混合的a／β蛋白，分為兩個domain，即N-domain(60～265氨基酸)和C-domain(266～461氨基酸)，C-domain能夠與NAD結合，突出的N-domain與Vip1蛋白相互作用。

對于典型的A-B型二元毒素，兩個功能不同的亞基或結構域必須組裝成復合物才能發揮活性。但Vip1和Vip2的作用方式不同，二元毒素的兩種多肽并不結合，而是獨立行使功能。100 ku的Vip1多聚體具有膜結合能力，為Vip2進入靶標昆蟲細胞質提供途徑；含有NAD結合位點的Vip2具有ADP-核糖基轉移酶活性，可能在Arg177處阻止肌動蛋白的多聚化，引起肌動蛋白無法構成細胞骨架，由于肌動蛋白微絲亞基的快速交接從而導致昆蟲最后死亡。

2Vip3

2.1Vip3A的殺蟲活性

Vip3A對草地貪夜蛾(Spodoptera frugiper-da)、甜菜夜蛾(S.exigua)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)等對ICPs不敏感或低敏感的昆蟲具有廣泛的殺蟲活性，且毒效都在納克(ng)水平上，對小地老虎(Agrotis ipsilon)的毒性比Cry1Ac高260倍，但對鞘翅目昆蟲無效。Vip3A類蛋白間的序列相似性在98.6％～100％之間，已有文獻報道該類蛋白僅第206、284、291、406、464、742位氨基酸的變動頻率偏高，隨著研究的深入，目前已經鑒定的Vip3A蛋白共28個，通過氨基酸序列比對，發現Vip3A蛋白在第284、358、406、536、633、755、761、776位氨基酸的變動頻率均較高。但僅幾個氨基酸的差異，蛋白間的殺蟲譜和毒性卻差異很大。Vip83蛋白N端比Vip-C9蛋白多兩個氨基酸，對小菜蛾表現高活性，而Vip-C9對小菜蛾的活性很低。

2.2vip3A基因的分布和保守性分析

vip3A基因廣泛存在于Bt菌株中，分布率為15％～63％。劉金環等從606株Bt菌株中鑒定出382株含有vip3A基因，分布率高達63％，其中315株含有與mip3Aal相同的基因帶型。

作者從本實驗室分離并保存的171株野生型Bt菌株中篩選出63株含vip3A基因的菌株，vip3A分布率為36.84％，63株均含有與vip3Aal相同的基因帶型(申建茹、郭巍，待發表)，這與前人的研究結果一致，充分說明該類基因在遺傳上比較保守，可能是Bt菌株某種結構或功能所必需的關鍵基因。

2.3vip3A基因的鑒定及其定位研究

GenBank收錄的vip基因大多屬于vip3A型基因。截至2008年4月9日，GenBank已收錄的vip3A全長基因共有28個，具體見表1。1996年Estruch等研究發現，vip3A(a)基因位于染色體DNA上，但是此后定位研究表明vip3A基因是定位于質粒上，因此該類基因的定位是因菌株而異還是全部定位于某特定質粒上，仍有待研究。

2.4Vip3A(a)蛋白的結構與功能

Vip3A(a)的分子量為88 ku，N-端含有帶正電荷氨基酸(Asn2～Lys7)及其相連的疏水核心功能區(Leu8～Met34)，這與其他芽孢桿菌的信號肽序列類似。但是Vip3A(a)蛋白N-端缺少信號肽酶作用位點，因此，易位時不進行N-端加工，這種情況在G⁺細菌中較少見。功能結構域分析表明，其N-端存在一個引導序列，不被切除卻起著分泌到細胞外的作用，C-端存在纖維素結合結構域(CBD)相似肽。初步說明了Vip3A是一種與信息傳遞相關的蛋白，在分泌到細胞外后可能要發揮某種功能，而C-端結合結構域則可能正是發揮蛋白功能的區域。

Estruch等研究表明，C-端150個氨基酸區域決定Vip3A(a)殺蟲譜，Selvapandiyan等證明缺失C-端220個氨基酸的Vip3A-S對斑禾草螟和斜紋夜蛾都失去了殺蟲活性，證明Vip3A蛋白C-端含有穩定功能區，對于維持Vip3活性至關重要，缺失或增加幾個氨基酸都會使它的活性完全喪失，因此不同Vip3蛋白C-端的變異可能是對不同生物活性的選擇。陳建武等構建缺失N-端27個氨基酸的Vip-S184缺失體失去了對甜菜夜蛾和斜紋夜蛾幼蟲的殺蟲活性，揭示了Vip3A信號肽序列對該類基因的殺蟲活性是十分重要的，而且在大腸桿菌中對于蛋白可溶性、包涵體形成位置和殺蟲活性等是必需的，在Bt中影響蛋白的表達時相、分泌性和殺蟲活性。劉榮梅等通過構建缺失蛋白Vip-C9-N，也表明N-端信號肽序列(39個氨基酸)對甜菜夜蛾的活性是必需的。

2.5Vip3A的作用機理

Vip3A(a)與敏感昆蟲的中腸液進行混合處理后，可形成4條主要蛋白帶：22 ku、33 ku、45 ku和66 ku。非敏感昆蟲的中腸液也可以將Vip3A蛋白水解成上述4種蛋白帶，但是并不會導致明顯的病理變化。Vip3A蛋白僅結合在敏感昆蟲的中腸細胞上，因而Vip3A(a)的殺蟲作用譜和其與中腸上皮細胞結合與否直接相關。

細胞病理學試驗表明：飼喂小地老虎和草地貪夜蛾等敏感昆蟲Vip3A(a)蛋白72 h后，中腸上皮杯狀細胞和柱狀細胞與基膜完全脫落，昆蟲死亡。Vip3A引起的癥狀與ICPs的相似，但是時間上推遲了。Vip3A蛋白只要在pH低于7.5時即可溶解，其C-端也不被切除，與敏感昆蟲上皮結合，誘發昆蟲細胞凋亡(PCD)，細胞核溶解，最終昆蟲死亡。Lee等根據煙草天蛾BBMV的配體印跡發現，Vip3A與CrylAb毒蛋白在煙草天蛾中腸上的受體明顯不同，為一類80 ku或100 ku左右的蛋白，而激活的CrylAb毒蛋白的受體是120 ku的氨肽酶(APN)類似物和250 ku的鈣黏蛋白(cadherin)類似物。蛋白雜交試驗證明，Vip3A并不是結合到已知的Cry1Ac的受體上，并且Vip3A與Cry1Ac和Cry2Ab2之間存在著對BBMV的非競爭性結合。

3Vips的應用前景

蘇云金芽孢桿菌在對數生長期表達分泌的蛋白質對于殺蟲活性來說是一個極豐富的資源，表現出較為廣闊的應用前景。

3.1構建工程菌

通過Vips之間、Vips和ICPs之間以及Vips和其他與殺蟲有關的蛋白之間融合構建嵌合蛋白，將為有效地構建特異高毒力工程菌提供新的途徑。將Vip1和Vip2的受體結合功能區或易位功能區與其他殺蟲蛋白融合，可以增大融合蛋白的殺蟲范圍或增強其殺蟲活性。Vip3A和ICPs之間可能存在著協同增效作用；將不同生物活性的vip基因通過基因序列交換或者改造，可以獲得殺蟲譜更廣、活性更高的融合基因；將vips基因單獨在高毒力Bt菌株中進行表達或將該基因與ICPs基因進行共表達，構建的工程菌株對于擴大殺蟲譜、提高殺蟲活性和延緩抗性等方面均具有重要意義。

3.2構建轉基因植物

對vip3基因的研究利用也可以作為轉基因植物抗性管理策略之一。Vip3新菌株、新殺蟲特性、新殺蟲蛋白及其編碼基因的發現和報道層出不窮，為構建轉基因植物提供了新的殺蟲基因資源，vip3A(a)基因可以全序列或以毒性片斷導入植物。現在Vips已經成功地應用于轉基因殺蟲植物的構建，先正達公司已成功地將Vip3A導入不同作物，得到高效抗蟲多價轉基因玉米、棉花，延緩了抗性發展。2004年，先正達公司將轉包括該基因的多價轉基因棉花在美國進行田間釋放試驗，大大提高了植物的抗蟲性，降低了防治費用，減少了環境污染，降低了損失，顯示了很好的應用前景。

3.3殺蟲活性物質的篩選

Vip1、Vip2、Vip3 3種殺蟲蛋白具有特殊的殺蟲作用機理，可以為篩選新的殺蟲活性物質提供新的思路，可用于篩選誘發細胞凋亡或者是跨膜前后產生活性的化學配體，包括生物小分子、多肽或蛋白質。

3.4其他方面

可以將vip基因導入其他芽孢桿菌或酵母、其他殺蟲微生物或者根際微生物，有利于原有性狀的改良。此外，對VIPs的研究對于研制廣譜殺蟲劑具有重要的意義，也具有潛在的應用價值。