一種高效分離荔枝霜疫霉病菌的新方法

岑貞陸　黃思良

摘要作者將常規植物病原菌組織分離法改進成一種適合于荔枝霜疫霉病菌分離的簡便、高效的新方法。分離的荔枝果實經過100μg／mL多菌靈及36μg／mL鏈霉素的混合藥液浸泡處理，在無菌保濕的條件下采用病果對健果進行病害誘發后進行病原菌的分離純化。該新方法分離荔枝霜疫霉病菌的成功幾率大于傳統組織分離法。

關鍵詞荔枝；霜疫霉病菌；分離

中圖分類號S 436.67

荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)是荔枝的主要病害之一，其分類學地位是一科一屬一種，較為特殊。為了對荔枝霜疫霉病菌進行相關研究，通過分離而獲得純的荔枝霜疫霉病菌是必要的。常規的病原菌分離方法是《植病研究方法》介紹的用75％乙醇和0.1％升汞液表面消毒處理。實際工作中，在實驗室進行分離的樣本往往不是新鮮樣品，特別是存放時間過長的荔枝病果組織中常常帶有其他雜菌，按常規方法進行分離組織病原菌時，由于這些雜菌的生長較荔枝霜疫霉病菌迅速，雜菌的菌絲常將荔枝霜疫霉病菌覆蓋，而細菌也會抑制荔枝霜疫霉病菌的生長。另外，荔枝霜疫霉病菌在常規培養基如PDA上生長較差，而特殊培養基的配制又相對麻煩。因此，采用常規分離真菌方法分離荔枝霜疫霉病菌分離純化效果差，往往不易成功。為此，作者試將常規的真菌分離方法改進成一種更為簡便快捷分離荔枝霜疫霉病菌的新方法。

1分離操作

先將加熱熔化了的純瓊脂培養基倒入培養皿中，待培養基凝固后用打孔器(直徑為3～4mm)將培養基打成圓碟備用。再準備兩個無菌的容器，容器內裝有用無菌水配成的含有100μg／mL多菌靈及36μg／mL鏈霉素的混合藥液。將新采集的荔枝病果(品種為黑葉)置于RH為90％的密閉干燥器3～5d后，再采集新鮮健康果實(品種為黑葉)，然后將病果、健果分別浸泡于上述混合藥液中10min后撈起，分開晾干，在無菌塑料盒中放置4～8個健果(緊靠在一起排成一字形)，在隊列一端緊靠健果再放置1個病果，室溫下使健果發病，當健果發病后，將原先的病果移走，依此類推，移走3～5個病果后，用接種針挑取純瓊脂圓碟，將純瓊脂圓碟輕觸塑料盒中病組織上的病菌孢子囊梗(注意：純瓊脂圓碟不要點觸到荔枝果皮)，使病菌分生孢子囊粘在純瓊脂圓碟上，然后將純瓊脂圓碟置于玉米粉瓊膠培養基(玉米粉300g、瓊脂17g、水1000mL)平板中央，于25℃恒溫箱中培養，待病菌形成菌落，鏡檢觀察其培養性狀及有無其他雜菌，確認是荔枝霜疫霉病菌并進行單孢子純化，經柯氏法則確認其致病性后，將病原菌保存備用。

2分離結果

在采用新方法進行分離的試驗中，共挑刺107個純瓊脂圓碟，5d后觀察到有83個純瓊脂圓碟在玉米粉瓊膠培養基平板上長出荔枝霜疫霉病菌菌落，其中有34個荔枝霜疫霉病菌菌落受到其他雜菌的污染，結果顯示，分離出純荔枝霜疫霉病菌培養物的頻率為45.79％；而采用傳統組織分離方法進行分離的試驗中，共對96個組織塊進行分離，5d后觀察到長出真菌或細菌菌落的組織塊共68個，對分離所得的真菌菌落進行鏡檢，沒有觀察到荔枝霜疫霉病菌。

3小結

與常規組織分離方法相比，該新方法具有以下優點：(1)簡便、快捷、實用，不需要配制特殊的培養基，并省去乙醇和升汞消毒處理。(2)荔枝果實先經過藥液浸泡處理，絕大部分雜菌已被殺死或被抑制，分離成功幾率大。