脂肪組織工程研究進展

每年全世界有數百萬例因創傷、腫瘤切除術和先天性缺陷導致的軟組織缺損患者，需要通過手術進行修復重建。這些缺損常因脂肪組織缺失而導致正常組織形態改變和功能障礙。恢復缺損部位組織的功能，通常不是修復重建的主要目的，手術治療的主要目的是恢復局部外形，使毀容所造成的心理創傷降到最低。目前的軟組織重建常用方法包括各種組織瓣移植或人工合成替代物的植入，但目前尚無一種填充材料可以滿足所有的臨床需要。利用自體脂肪組織移植（游離移植或真皮脂肪瓣移植）修復軟組織缺損的歷史比較久遠，也有不少臨床應用的報告，但因游離移植的脂肪成活率低、容易吸收，真皮脂肪瓣移植操作復雜、不易塑形，效果并不十分理想。因此，應用組織工程學原理來構建脂肪組織已成為組織工程研究領域的熱點之一。本文主要回顧脂肪組織工程的研究現狀和新近的研究策略。

1脂肪組織工程的基本原理

脂肪組織工程即應用正常脂肪組織的活細胞，在體外進行大規模培養，并接種到三維結構的生物相容性支架上，然后將其從體外培養環境轉移至體內，并能促進與受區細胞整合和血管長入；最終，該構造在支架降解過程中逐步被宿主的健康軟組織取代。為使組織工程化脂肪成功地應用于臨床上的軟組織重建，必須處理好組織工程程序中所有的關鍵點，包括種子細胞和支架材料的選擇、細胞培養的環境和轉移方式。

1.1脂肪組織工程的細胞來源：成功地構建脂肪組織工程的第一步，是搞清楚脂肪形成過程，并確定一種適當的種子細胞。已有研究者采用前脂肪細胞(preadipocyte)和成熟脂肪細胞（Mature adipocyte）來修復組織缺損[1]，但通過吸脂獲得的自體脂肪組織，在移植后由于不能盡快地重建血運而無法得到充足的血供，使組織難以長期存活，常常導致移植的脂肪組織被吸收。脂肪細胞胞漿內的脂質對吸脂操作的損傷十分敏感，大量細胞遭到破壞而無法保持期望的體積大小。另外，成熟的脂肪細胞在培養過程中處于分化終末期，其增殖能力有限，不能輕易地擴增，因此阻礙了它們在組織工程方法中的進一步應用[2]。

前脂肪細胞，是脂肪組織間質-血管成分中的前體細胞，這些細胞在分化前呈梭狀或成纖維細胞樣[3]。經分化后發生形態學和生物化學改變，變為圓形，并開始蓄積三酰基甘油，形成脂質空泡[4]。前脂肪細胞被認為是一種比成熟脂肪細胞更好的種子細胞，因為它們容易培養、擴增，而且容易獲得，不僅能擴大增殖到更多的細胞數，而且能分化為成熟的脂肪細胞[5]。然而，前脂肪細胞經多次傳代后，也會喪失分化能力[6]。

干細胞生物學的研究及應用也許能為脂肪組織工程提供一種理想的自體細胞來源。干細胞是一類具有自我更新與增殖分化能力的細胞，能產生表現型與基因型和自己完全相同的子細胞，同時還能分化為祖細胞。干細胞按其分化階段的不同，可以分為胚胎干細胞（embryonic stem cell）和成體干細胞（adult stem cell）兩類[7]。干細胞的應用能供給大量的細胞，如果成體干細胞的應用得以成功，那么就能利用患者自己的細胞構建組織，由此消除了其他來源細胞的排斥反應[2]。目前，利用干細胞產生脂肪組織的研究已經愈來愈受矚目，來源于骨髓和脂肪組織的干細胞極有希望成為可供脂肪組織工程選擇的種子細胞來源。

骨髓中含有的造血干細胞是現今被公認的間充質干細胞源。來源于骨髓的干細胞(BMSCs)存在于骨髓間質中，它們具有多能性，可分化為以下細胞譜系：脂肪細胞、骨細胞、肌細胞、肌腱細胞和神經細胞[8]。BMSCs一般是從骨髓移植供者身上抽取的骨髓中獲得的，這種方法難免會給患者帶來痛苦。骨髓干細胞經體外培養會呈現成纖維細胞樣形態。有關骨髓基質干細胞的表面標記已經確定，這些標記可用于細胞選擇和測定骨髓干細胞的數量[9]。骨髓干細胞除了具有分化為多重細胞譜系的能力外，還能為組織工程應用提供一個在體外相對容易分離和擴增的細胞源。通過移植一小塊供體組織，就能使細胞數顯著增加。Vashi等[10]用BM-MSC和普盧蘭尼克F-127水凝膠制造了一個三維培養系統，試圖在體外構建組織工程化脂肪。BM-MSC被分散在普盧蘭尼克F-127水凝膠上，并加入I型膠原。兩周后，在脂肪形成刺激素存在的條件下，BM-MSC分化為脂肪細胞。BM-MSC分化形成脂肪細胞，經油紅O染色得到證實。

與骨髓來源間充質干細胞相比，脂肪組織來源干細胞（adipose derived stem cell ，ADSC）具有同等的分化為中胚層起源的細胞和組織的潛力，例如脂肪細胞、軟骨、骨和骨骼肌[11]。ADSCs還顯示出與骨髓來源干細胞非常相似的形態學表型[12]。除了它們共同的多能性，一些在骨髓干細胞表面發現的CD抗原標記，同樣也能在ADSCs上發現[13]。 由于脂肪來源干細胞可從皮下脂肪組織中獲得，并能很容易地被分離出來，在活體外和或體內都顯示出快速地增殖并分化為成熟脂肪細胞的能力，為脂肪組織工程提供了一個光明的應用前景。然而，ADSCs的應用也有其局限性，目前認為ADSCs并不是萬能的，它在體外大規模培養后也表現出明顯的“衰老”跡象，由此限制了其移種能力。此外，脂肪組織在代謝活動中會發生改變，它的增殖和分化能力依賴于組織定位和患者的年齡及性別[13]。

近期，美國和日本的科學家研究出由人類體細胞誘導得來的多能干細胞（iPS）。他們的研究表明，用已確定的四種轉錄因子（OCT4、SOX2、NANOG和LIN28）能夠將人體細胞改變為多能干細胞，這種細胞具有胚胎干細胞的基本特征。這些誘導形成的人類多能干細胞有正常的核型，表達端粒末端轉移酶活性，表達人體胚胎干細胞的特征性細胞表面標記物和基因，并保持著內、中、外三個胚層所有的進一步分化衍生的發育潛能[14]。由于人體胚胎干細胞的來源牽涉到人類植入前胚胎的破壞，目前對胚胎干細胞的應用仍有倫理方面的爭議；iPS不是來源于胚胎的細胞，因此消除了這一疑慮。這種人類誘導的多潛能細胞系將會對人體組織功能的研究和發展起到重要作用，同樣也有可能應用到組織工程領域。但必須清楚地意識到，還需要進一步的研究以克服技術上的局限性（例如病毒整合引起的基因突變）。

1.2脂肪形成的分子調控：現已鑒定出一些在控制脂肪形成中起重要作用的轉錄因子，它們是CCAAT/強化因子結合蛋白基因家族和過氧化物酶活性增殖子γ-受體。還有激素和生長因子，例如胰島素及胰島素樣生長因子（IGF），能傳遞外部信號刺激脂肪細胞分化，促進脂肪形成及血管發生[15]。向胎牛血清培養基中加入地塞米松、甲狀腺激素或胰島素等誘導劑，能使前脂肪細胞和干細胞的體外分化得到加強。進一步在分子水平上了解脂肪形成的機制，將有助于構建組織工程化脂肪并促進脂肪組織再生。

1.3 脂肪組織工程的支架材料：支架材料在組織工程組織的構建中占有舉足輕重的地位。理想的三維支架應具有臨時細胞外基質（ECM）的作用，為脂肪組織工程種子細胞提供附著、增殖、分化和營養代謝的場所。細胞以其附著的三維支架為模板，發展形成新的脂肪組織。現已研究出許多應用于脂肪組織工程的不同種類的人工合成支架材料，包括聚乙醇酸（PGA）、聚對苯二甲酸乙酯（PET）、多聚共乳乙交酯酸（PLGA）和聚四氟乙烯（PTEF）。天然衍生材料，例如膠原，透明質酸衍生物，基質膠和纖維蛋白等也已得到研究。在設計支架的時候，有許多因素值得考慮，包括支架的機械性能、降解特性、免疫原性、細胞對材料的反應性，在臨床應用中是否易于操作并能減少成本[16]。理想的材料修飾是將生物活性成分與支架材料結合，使支架成為一個生物分子控釋系統，以使生物活性分子的釋放持續于支架降解全過程。這些加工技術的改進，使脂肪組織工程的支架材料有可能與細胞粘附分子、趨化因子和生長因子結合，系統地調控脂肪干細胞的粘附、分化、增殖和代謝功能，從而促進組織工程化脂肪的形成。最近納米級結構材料的發展與分子生物學研究結果的結合[17]，可使生物活性分子在材料中有序組裝，將對組織工程發展產生深遠影響。

2脂肪組織工程研究策略及其進展

現在已有許多構建脂肪組織的策略。這些策略通常是將前脂肪細胞播種在由可被吸收的聚酯、透明質酸、膠原、聚乙二醇（PEG）和化學改性藻酸鹽等材料構成的聚合物支架上。應用于脂肪組織工程研究中的支架形狀各不相同，比如聚合物盤、海綿、泡沫和可注射的微球[2]。傳統的脂肪組織工程策略，是從患者身上吸取或切除的脂肪組織中獲得前脂肪細胞和毛細血管內皮細胞，并通過酶消化作用將它們分離出來。把前脂肪細胞與適當的生長因子一起培養在多聚體支架上，然后將該支架植入到患者軟組織缺損處。理想的結果是隨著支架改型或吸收，前脂肪細胞會不斷生長、增殖，并最終發育成熟為脂肪組織。Patrick等[18]應用這種方法證明了前脂肪細胞具有分化成為成熟脂肪細胞的能力，而細胞在PLG支架上的生長狀況說明前脂肪細胞經移植后具有長期的存活力。脂肪細胞的產生可通過組織學染色和熒光標記方法進行鑒定。這一基本的脂肪組織工程策略主要以前脂肪細胞的應用為重點，而忽視了用來構造支架的材料方面的問題。

后來的研究對材料進行了修飾，使之盡可能地增強細胞的粘附增殖及生物相容性。Hemmrich等[19]比較了裝載有前脂肪細胞的透明質酸和膠原這兩種生物材料對于脂肪組織工程的適用性。結果證明該方法能夠使脂肪組織在活體內重新形成，但是支架孔徑的大小和穩定性是限制細胞在其構造中充分分布的客觀因素。他們在后面的研究中制作了一個新的可降解基質：聚酯衍生的非針織物。這種材料是應用紡織制造業中的空氣動力學網狀物形成方法和針毯技術而制成的，它是以己內酰胺、已二酸和1，4-丁二醇為基礎的三維結構。把人的前脂肪細胞播種到該支架上，并對細胞增殖分化進行檢測，結果顯示聚酯材料允許前脂肪細胞很好的粘著、增殖和分化。這些研究對于設計一種能使細胞相互作用最佳化的支架具有指導作用。由于脂肪來源干細胞（ADSC）能較好地經受住來自抽吸套管的機械性損傷，移植后具有良好的細胞存活力并能再生新的脂肪組織，Rubin等[20]用多孔的膠原微球作為細胞載體來培養和移植ADSCs，經過試驗證明該策略是可行的。這一策略將ADSCs在體外誘導分化，然后將細胞和支架精確地置入組織床內，觀察干細胞在這些微球內增殖和分化的能力。研究者從人脂肪組織中分離出脂肪來源干細胞并置于微球上，在攪動生物反應器內進行培養。培養幾周后，細胞在微球上附著、增殖并保持高度活力。結果發現膠原微球對脂肪來源干細胞是一種良好的支架，能夠使細胞在顆粒上進行體外增殖和分化，并且這些微球顆粒小到能以注射的方式植入到組織缺損部位。

另一個新穎的研究策略是完全以細胞為基礎的重建方法。Melanie Vermette等[21]利用適當的“自組裝”培養方法學，試圖創造一個新的、完全自體來源的組織工程脂肪替代物。他們應用來源于抽吸或切除下來的脂肪中的間充質干細胞進行體外培養，在脂肪細胞分化發生的過程中，添加維生素C，從而刺激間質細胞自己產生細胞外基質（ECM）。有功能的脂肪細胞長入到自身分泌的ECM支架內，形成一個天然的“生物材料”。經掃描電鏡觀察，這些重建的脂肪組織的形態與皮下脂肪十分相似，而且能分泌脂肪動員因子并發揮β-腎上腺素刺激性受體介導的脂解作用，具有白色脂肪組織主要的生物學功能。因此，這種以細胞為基礎的組織工程策略，能夠產生一種有功能的完全天然的脂肪組織，為特定的體外和自體軟組織重建提供應用可能。

3脂肪組織工程的臨床應用和展望

盡管眾多學者進行了大量的研究工作，組織工程化脂肪替代物由于種種原因尚未能應用于臨床，這表明需要進一步優化目前的支架模型并改革創新構建這種特殊類型組織的策略。目前干細胞在組織工程中的應用是研究的熱點，有許多相關的問題需要解決，包括組織獲得方法的標準化、細胞分離和培養。直到今天，沒有發現一種確定的成體干細胞標記，可以保證所有干細胞群的純凈[22-23]。缺乏這樣的標記，有可能使干細胞的應用存在變異性。但無論如何，干細胞在脂肪組織工程的研究中已顯示出了良好的應用前景，干細胞接受適當刺激后有分化為內皮細胞和脂肪細胞的能力，將有利于形成一個血管化的脂肪移植物，為應用組織工程脂肪組織進行軟組織重建帶來了希望。

[參考文獻]

[1]Niemela SM，Miettinen S，Konttinen Y，et al.Fat tissue: views on reconstruction and exploitation[J].J Craniofac Surg，2007，18(2):325-335.

[2]Gomillion CT，Burg KJ.Stem cells and adipose tissue engineering[J].Biomaterials，2006，27(36):6052-6063.

[3]Patrick CW. Breast tissue engineering[J].Annu Rev Biomed Eng，2004，6:109-130.

[4]Beahm EK，Walton RL，Patrick CW.Progress in adipose tissue construct development[J].Clin Plast Surg，2003， 30(4):547-558.

[5]Hemmrich K，von Heimburg D，Rendchen R，et al.Implantation of preadipocyte-loaded hyaluronic acid-based scaffolds into nude mice to evaluate potential for soft tissue engineering[J].Biomaterials，2005，26(34):7025-7037.

[6]Rodriguez AM，Elabd C，Delteil F，et al.Adipocyte differentiation of multipotent cells established from human adipose tissue[J].Biochem Biophys Res Commun，2004，315(2):255-263.

[7]Brivanlou AH，Gage FH，Jaenisch R，et al.Setting standards for human embryonic stem cells[J].Science，2003， 300(5621):913-916.

[8]Ballas CB，Zielske SP，Gerson SL.Adult bone marrow stem cells for cell and gene therapies:implications for greater use[J].J Cell Biochem Suppl，2002，38:20-28.

[9]Barry FP，Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization[J]. Int J Biochem Cell Biol，2004，36(4):568-584.

[10]Vashi AV，Keramidaris E，Abberton KM，et al. Adipose differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells using Pluronic F-127 hydrogel in vitro[J].Biomaterials，2008，29(5): 573-579.

[11]Schaffler A，Büchler C.Concise review:adipose tissue-derived stromal cells--basic and clinical implications for novel cell-based therapies[J].Stem Cells，2007，25(4):818-827.

[12]Lee RH，Kim B，Choi I，et al.Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue[J].Cell Physiol Biochem，2004，14(4-6):311-324.

[13]Tholpady SS，Llull R，Ogle RC，et al.Adipose tissue: stem cells and beyond[J].Clin Plast Surg，2006，33(1):55-62.

[14]Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J].Science，2007，318(5858):1917-1920.

[15]Niemela SM，Miettinen S，Konttinen Y，et al. Fat tissue: views on reconstruction and exploitation[J].J Craniofac Surg，2007，18(2):325-335.

[16]Flynn L，Prestwich GD，Semple JL，et al. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells[J].Biomaterials，2007，28(26):3834-3842.

[17]辛敏強，穆蘭花，欒 杰，等.乳房組織工程的研究現狀[J].中華整形外科雜志，2007，23 (6):546-548.

[18]Patrick CW Jr，Zheng B，Johnston C，et al.Long-term implantation of preadipocyte-seeded PLGA scaffolds[J].Tissue Eng，2002，8 (2):283-293.

[19]Hemmrich K，Meersch M，Wiesemann U，et al.Polyesteramide-derived nonwovens as innovative degradable matrices support preadipocyte adhesion， proliferation， and differentiation[J].Tissue Eng，2006，12(12):3557-3565

[20]Rubin JP，Bennett JM，Doctor JS，et al.Collagenous microbeads as a scaffold for tissue engineering with adipose-derived stem cells[J].Plast Reconstr Surg，2007，120(2):414-424.

[21]Vermette M，Trottier V，Menard V，et al.Production of a new tissue-engineered adipose substitute from human adipose-derived stromal cells[J].Biomaterials，2007，28(18):2850-2860.

[22]Conrad C，Huss R.Adult stem cell lines in regenerative medicine and reconstructive surgery[J].J Surg Res ，2005，124(2):201-208.

[23]朱 茗，高建華，魯 峰. 脂肪組織再生的組織工程研究進展[J].中國美容整形外科雜志，2007，18(3):216-219.

[收稿日期]2008-03-02 [修回日期]2008-05-25

編輯/李陽利