骨保護素在犬恒牙胚發育中的表達及意義

[摘要]目的：探討犬乳恒牙替換過程中骨保護素在犬恒牙胚發育中的表達及意義。方法：分別對乳牙期、替牙期、恒牙期本地犬取牙胚及其周圍組織，制備石蠟切片，進行HE染色和牙胚內OPG的免疫組化染色，用彩色病理圖像分析系統分析各組染色強度灰度值。結果：乳牙期、替牙期犬牙胚的成牙本質細胞OPG的免疫組化強度明顯高于另外一組，成釉細胞中也有陽性信號。結論：OPG可能參與恒牙胚的形成和發育。

[關鍵詞]犬恒牙胚；骨保護素；成牙本質細胞；成釉細胞

[中圖分類號]R781 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）06-0877-2

The expression and significance of osteoprotegerin in the the development of of dogs' permanent teeth germs

CHEN Li-ping1，WU Wei1，BAI Hui-ying1，YANG Fu-sheng2

(1.Department of Dentistry， Qinghai Provincial Corps Hospital，Chinese Pepole′s Armed Police Force， Xi′ning 810001，Qinghai，China;2.College of Stomatology，Fourth Military Medical University)

Abstract:ObjectiveTo study the expression and significance of osteoprotegerin（OPG）in the development of dogs'permanent teeth germs. MethodsDogs of different ages were selected as objects，selected permanent teeth germs and their peripheral tissue of dogs in different periods of primary dentition roots stability，primary dentition roots resorption，permanent dentition，preparating of paraffin slice.HE dyeing and OPG immunohistochemical dyeing were analysing the gray value of dyeing tense.ResultsOPG dyeing tense of immunohistochemic in odontoblasts of the germs in period of primary dentition roots stability and primary dentition roots resorption is stronger than the other team.OPG position signals were observed on ameloblasts. ConclusionOPG probably takes partin the formation and development of dogs'permanent teeth germs.

Key words:dogs'permanent teeth germs;osteoprotegerin(OPG);odontoblasts;ameloblasts

骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族成員，其主要生物學作用是抑制破骨細胞(osteoclast，OC)形成、分化和增加骨密度，是抑制骨吸收的關鍵因子。有研究表明， OPG基因表達在牙濾泡，在牙齒萌出中發揮一定作用。而在恒牙胚發育中的作用卻未見相關報道。本實驗主要通過對犬恒牙胚成牙本質細胞中OPG的表達進行研究，探討OPG在此過程中的作用。

1材料和方法

1.1材料及分組：動物選用本地犬共3只，分為3組，A組：乳牙牙根穩定犬(8周齡)；B組：乳牙牙根吸收犬(18周齡)；C組：成年恒牙列犬(22周齡)。

1.2試劑：兔抗人OPG多克隆抗體(北京博奧森生物工程有限公司)；SABC免疫組化檢測試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司)。

1.3切片標本制作及觀察：分別將實驗犬以速眠新Ⅱ注射液按0.2ml/kg肌注麻醉，解剖分離雙側頸動脈后斷頭處死，頸動脈插管，用生理鹽水沖洗，4%甲醛固定液進行灌注組織內固定，分離上、下頜骨，4%甲醛固定液外固定24h，上、下頜骨于甲酸、甲酸鈉脫鈣液中4℃脫鈣，4周后分切成小塊，再脫鈣4周。脫鈣后，分切、修整、酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，制作5μm厚石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，常規HE染色，每只犬取5張切片共30張，每張切片光學顯微鏡下觀察根尖組織。

1.4免疫組化染色及圖像分析：切片脫蠟至水，一抗為兔源性抗體，稀釋度1:350，其余步驟按試劑盒進行。用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統分析染色強度的灰度值，每個時期10張切片，每張切片隨機選取4個成牙本質細胞進行測量。

2結果

A組：8周犬乳牙根未發生生理性根吸收，恒牙胚牙冠發育處于牙體組織形成期，牙本質、牙釉質基質開始形成。成釉細胞、成牙本質細胞高柱狀，胞核橢圓形，遠離基底膜，整齊排列，極性倒置明顯。此時可見恒牙胚內成牙本質細胞及成釉細胞染色陽性，染棕黃色。空白對照組染色陰性。B組：18周犬乳牙根發生生理性吸收，恒牙胚冠部牙本質、牙釉質進一步形成和礦化，成釉器萎縮、上皮根鞘向根方生長，形成上皮隔，并可見上皮根鞘發生斷裂。此時恒牙胚內成牙本質細胞及成釉細胞染色陽性（如圖1），空白對照組染色陰性。C組：22周成年犬恒牙列，乳牙已脫落，恒牙萌出。恒牙成牙本質細胞染色陰性。經彩色病理圖像分析系統分析，成牙本質細胞染色灰度值分析見表1。

經LSD檢驗，成牙本質細胞A、B組與C組間P＜0.05，即免疫組化染色強度A、B組與C組間有顯著性差異，說明成牙本質細胞表達OPG的強度不同。成牙本質細胞、成釉細胞A組與B組間P＞0.05，即這兩類細胞免疫組化染色強度A組與B組間無顯著性差異。

3討論

OPG是Simonet等[1]1997年在胎鼠小腸 cDNA文庫中克隆出的一種新型分泌型糖蛋白，是缺乏跨膜結構域的腫瘤壞死因子受體超家族成員，具有降低OC分化和增加骨密度的功能。人類OPG基因定位于染色體8q23-24，包含5個外顯子，在體內以單體和同源二聚體兩種形式存在。OPG mRNA具有廣泛的組織分布，在骨骼，OPG主要由成骨細胞和骨髓基質細胞產生。而骨的形態結構是通過不斷的吸收與形成來維持的，骨的形成主要由成骨細胞負責，在骨量維持中起重要作用。研究發現過量表達 OPG的OPG轉基因(opg+/+)小鼠表現為骨質硬化癥，骨質堅硬，骨髓腔縮小，呈現明顯的大理石樣變，而 OPG基因敲除(opg-/-)小鼠在成熟前即顯示嚴重的骨質疏松[2]。因此我們推測，OPG與牙齒硬組織礦化也可能存在一定的關系。

Yao S[3]發現在大鼠牙囊中有OPG的存在。金星愛等[4]研究發現，在牙齒萌出的骨內階段中期牙囊成纖維細胞、成釉細胞OPGmRNA呈強陽性表達。當成釉細胞成熟后，對牙乳頭發生誘導作用，分化為成牙本質細胞，成熟后的成牙本質細胞已具備合成蛋白質的功能。本實驗也發現：OPG的陽性信號出現于發育中的恒牙胚成牙本質細胞、成釉細胞中，鏡下觀察，兩類細胞高柱狀，細胞核大、橢圓形，遠離基底膜，這種細胞形態學特點反映其功能和狀態正處于活躍的基質分泌期；恒牙萌出后，其成牙本質細胞成為扁平狀，說明其功能處于靜止，染色結果為陰性。圖像分析的結果兩類細胞A、B兩組間灰度值稍有不同，但相差不顯著，提示牙胚發育期間，細胞的功能狀態可能差別不明顯，但成牙本質細胞A、B組與C組則有顯著性差異，說明恒牙萌出后，成牙本質細胞OPG染色強度明顯減弱，提示OPG可能參與了牙胚的形成和發育，推測可能與硬組織礦化有關。

[參考文獻]

[1]Simonet WS，Lacey DL，Dunstan CR，et a1.Osteoprotegerin:A novel secretedprotein involved in the regulation of bone density[J].Cell，1997，89:309-319.

[2]YAO S，RING S，HENK WG，et a1.In vivo expression of RANKL in the rat dental follicle as determined by laser capture microdissection[J].Arch Oral Biol，2004，49(6):451-456.

[3]Bucay N，Sarosi I，Dunstan CR，et a1.Osteoprotegedn deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification[J].Genes Dev，1998，12(9):1260-1268.

[4]金星愛.RANKL在犬乳恒牙替換期牙齦上皮中的表達[J].哈爾濱醫科大學學報，2007，41(4):333-337.

[收稿日期]2008-03-30[修回日期]2008-04-21

編輯/何志斌