新疆野生櫻桃李（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｉｆｅｒａ）莖段與葉片培養及其植株再生

摘要：以新疆野生櫻桃李為材料，研究了基本培養基、植物生長調節劑種類、濃度及配比、蔗糖濃度等多種因素對莖段腋芽萌發生長、增殖以及葉片不定芽冉生的影響，建立了其葉片再生體系。結果表明，1)植物生長調節劑組合IAA0.4rag/L+6-BA 0.8 mg/L較適合于櫻桃李莖段腋芽的萌發與生長培養；2)正交試驗篩選山不定芽的最佳增殖培養基為3/4MS+LAA，5malL+6-BAl.0mg/L+蔗糖30 g/L；3)ZT誘導不定芽再生的效果好于6-BA，zTl.5mg/L+IBA0.05mg/L為誘導不定芽再生的最適植物生長調節劑組合；4)暗培養為葉片不定芽再生的必要條件，在最適不定芽再生的培養基上，暗培養14 d的不定芽再于效果最好；5)櫻桃李不定梢的最佳生根培養基為1/2 MS+IBA 0.4mg/L。

關鍵詞：野生櫻桃李；莖段腋芽：葉片：植株再生

我國是多種果樹的起源演化中心，野生果樹資源極為豐富^[1]。現存的野生果樹資源。是長期自然選擇的產物，不僅其遺傳多樣性豐富，而且含有大量的抗逆等優異基因，其中由新疆野蘋果(Malus sieversii(Ldb.)Roerm.)、野生櫻桃李(Prunus cerasifera Ehrh.)、野杏(Arrneniaca vulgaris Lam.)及野核桃(Juglans re-gia L.)等組成的伊犁野果林是在中亞荒漠地帶山地罕見的“海洋性”闊葉林類型，是第三紀暖溫帶闊葉林的孑遺群落，是北方落葉果樹遺傳育種的基因庫，十分珍貴^[2]。但由于掠奪式的資源開發及農田開墾等因素而導致野生果樹資源破壞嚴重，野果林面積急劇減少，瀕臨滅絕。因此，研究并建立多層次保護保存技術體系，切實保護包括新疆野生櫻桃李在內的新疆野生果樹資源已是迫在眉睫^[3]。

國內外有關核果類果樹的組織培養研究報道甚多，但有關李的研究相對較少^[4]，馬鋒旺等^[5]首先對影響中國李(P.saliceina Lindl.)原生質體分離和培養的有關因素進行了研究，并成功獲得了原生質體再生植株。Seth等^[6]利用適當配比的TDZ與IBA組合成功誘導出歐洲李(只domestica)葉片再生植株；Bar-bara等^[7]研究了蔗糖、葡萄糖等碳源在歐洲李(P如一mestica)葉片再生過程中的作用，也成功獲得了葉片再生植株；櫻桃李(P.cerasifera Ehrh.)是歐洲李的親本之一，其組織培養的研究目前尚未見報道。為此，在課題組近幾年來對伊犁野果林進行了較多的考察與研究^[8-9]的基礎上。我們研究了野生櫻桃李莖段與葉片培養及其植株再生，旨在為進一步的野生櫻桃李種質資源超低溫保存和轉基因研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2005－2007年在山東農業大學作物生物學國家重點實驗室、山東農業大學泰安橫嶺果樹育種基地進行。試材為從新疆伊犁引種到山東農業大學泰安橫嶺果樹育種基地的3 a生櫻桃李植株。4－6月份選取當年萌發的枝條，將基部葉片摘除，保留頂部1-2片葉，先將材料放于水與洗潔凈的比例在1:500的溶液中沖洗，然后用試管刷除去上面的灰塵。用自來水沖洗后剪成2-3 cm長的莖段放于升汞(0.1％)中浸泡4-5 min進行表面滅菌，然后用無菌水沖洗6～7次。

1.2 方法

1.2.1 莖段腋芽培養與多叢芽再生體系的構建萌發與生長培養預備試驗結果表明櫻桃李莖段腋芽在生長素類物質質量濃度0.3～0.5 mg/L、細胞分裂素類物質質量濃度0.6-1.0 mg/L的培養基上生長較好。因此，生長素類物質質量濃度選定0.4 mg/L、細胞分裂素類物質質量濃度選定0.8 mg/L作為不同植物生長調節劑組合的濃度。生長素類物質選用IAA、NAA、2.4-D，細胞分裂素類物質選用6-BA、KT，共設A1、A2、A3、A4、A5及A6等6個處理(表1)，每個處理接種40個外植體。分別測定成苗數、真葉數、苗高等指標。各處理的基本培養基均為MS。各培養基中均加入蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，調pH值為5.8。培養條件：光照強度2000lx，光照時間12 h/d，溫度25℃。增殖培養采用k(3⁴)正交試驗設計進行增殖培養基的優選，4因素及3個水平分別是：基本培養基(MS、3/4MS與1/2MS)，IAA(0.7、0.5與0.3 mg/L)，6-BA(1.0、0.8與0.6 mg/L)，蔗糖(40、30與20 g/L)。各培養基中均加入瓊脂7 dE，調pH值為5，8。培養條件同1.2.1。每組接種40個外植體，測定其增殖系數，然后采用SAS 9.0版本統計軟件分析，數據采用極差分析法分析。

1.2.2 葉片再生培養在預備試驗及前人^[10]有關研究的基礎上。取25～30 d葉齡的組培苗，選取植株中上部葉片。棄去葉緣和葉尖，沿主脈兩側切3-4刀，接種于培養基上培養(圖版－4)，基本培養基及培養條件同1.2.1。

根據葉片通過器官發生再生不定芽的主要方式，研究植物生長調節劑組合6-BA與2，4-D和ZT與2。4-D對愈傷組織誘導的影響，植物生長調節劑組合6-BA與IBA和ZT與IBA對葉片不定芽再生的影響，其中6-BA與ZT所用的質量濃度均為：0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，2.4-D與IBA所用的質量濃度均為0.01、0.05、0.10、0.15 mg/L。每組接種40個外植體，測定愈傷組織誘導率、不定芽再生率和每外植體再生芽數。以葉片不進行暗培養為對照，暗培養時間設7、14、21、28 d等4個處理，以探討暗培養時間對葉片不定芽再生的影響。

1.2.3生根培養在本實驗室研究工作的基礎上^[11-12]選擇2種基本培養基(MS與1/2MS)及3種IBA質量濃度(0.6、0.4、0.2 ms/L)共6個處理進行生根培養試驗，分別測定各處理的生根條數，株和平均根長。

2 結果與分析

2.1 野生櫻桃李莖段腋芽培養與多叢芽再生體系的構建

2.1.1 植物生長調節劑組合對櫻桃李莖段腋芽萌發與生長的影響不同處理組合的莖段腋芽萌發與生長情況的調查結果見表1，各處理的成苗率、真葉數及苗高等存在一定差異，在選用的3種生長素和2種細胞分裂素中。IAA效果明顯好于2.4-D和NAA，6-BA效果好于KT，綜合來看，以處理A1(IAA 0.4 mg/L+6-BA 0.8 mrCL)效果最好(圖版-2)。因此，選定IAA和6-BA作為莖段腋芽萌發與生長的植物生長調節劑組合，并且在以后的試管新梢增殖中，延續使用這一組合。

2.1.2 櫻桃李不定芽增殖培養基的篩選C(6-BA)的極差(R)最大(2-3)，B(IAA)次之(2，O)，A(基本培養基)和D(蔗糖)的最小。因此，A、B、C、D4者對不定芽增殖的影響效果大小順序為：C>B>A>D(表2)。

從4列的K值可以得出：最佳培養基為A282C1D2，即3/4MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L。以此培養基作為櫻桃李不定芽增殖培養基，得到不定芽的增殖系數為7.1(圖版－3)。

2.2 野生櫻桃李葉片培養與植株再生

2.2.1 植物生長調節劑組合對愈傷組織誘導的影響 植物生長調節劑組合6-BA與2.4-D和ZT與2，4-D對愈傷組織誘導的影響見表3.6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.15 mg/L為誘導愈傷組織的最適植物生長調節劑配比，在此培養基上，愈傷組織誘導率達到最高(85％)，誘導出的愈傷組織有2種形態：緊密愈傷組織(圖版-5)和疏松愈傷組織(圖版-6)。但是在接下來的培養中，未見愈傷組織分化出不定芽。

2.2.2 ZT與IBA配比對葉片不定芽再生的影響在研究不同植物生長調節劑組合對葉片不定芽再生的影響過程中，發現試驗設計中16個配比的6-BA與IBA組合均不能誘導葉片不定芽再生，最后葉片變黃至枯萎。而櫻桃李葉片在適當配比的ZT與IBA組合作用下直接分化出不定芽(圖版7、8)，ZT 1.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L為誘導不定芽再生的最適植物生長調節劑配比(表4)，在此培養基上，野生櫻桃李葉片不定芽再生不經過或經過很少的愈傷組織階段。2，2，3暗培養對葉片不定芽再生的影響將葉片接種于誘導不定芽再生的最適培養基MS+ZT1.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L上，發現暗培養時間長短對葉片不定芽再生產生明顯差異，不經過暗培養處理的葉片再生率為0，暗培養14 d的效果最好，再生率達到最高(22.5％)。

2.3 櫻桃李不定梢的生根培養

從表5可以看出，在基本培養基相同的情況下，IBA濃度為0.4 mg/L時，生根條數，株和平均根長的數值最大，即生根的效果最好：在IBA濃度相同的情況下，不定梢在基本培養基1/2MS上的生根效果明顯優于在MS上的。因此，1/2MS+IBA 0.4 mg/L為野生櫻桃李不定梢生根培養的最佳培養基(圖版-9)。

2.4 組培苗的移栽

生長健壯的組培苗經過7～10 d的短期煉苗后，于10－11月份分批移入上部基質為消毒沙，下部基質為營養土(河沙：土：腐熟雞糞為1:1:1)的紙袋中，并加強光照，改善通風，在溫室內越冬，翌春定植于選種圃。

3 討論

3.1關于最佳增殖培養基的篩選問題

基本培養基的種類、蔗糖濃度及生長素與分裂素的種類、濃度及配比等是培養基篩選研究的重要內容。本文的正交試驗結果表明，植物生長調節劑對新梢增殖的影響效果遠大于基本培養基，這與大櫻桃吉塞拉芽的增殖^[13]、薰衣草芽的增殖^[14]研究結果相似。在植物生長調節劑中，6-BA對新梢增殖的影響效果大于IAA的，這與大櫻桃吉塞拉芽的增殖研究結果^[14]一致。進一步確定了3/4MS+IAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0mg/L為櫻桃李新梢最佳增殖培養基，其中分裂素(6-BA)與生長素(IAA)的比值為2，這一結果盡管與劉煥芳等^[11]在甜櫻桃與中國櫻桃雜種胚的組培試驗中篩選的最佳增殖培養基的激素配比一致(6 BA 2.0mg/L與IAA 1.0m/L的比值亦為2)，但研究發現，當分裂素(6-BA)的濃度高于1.2 mg/L時，櫻桃李新梢出現明顯的玻璃化現象。因此，對于不同植物多叢芽的增殖，需要通過系統試驗，來確定植物最佳生長調節劑種類、濃度及配比組合。

3.2 關于野生櫻桃李葉片不定芽再生的問題

葉片通過器官發生再生不定芽的主要方式是葉片經過愈傷組織階段誘導不定芽再生。本試驗研究結果表明。野生櫻桃李葉片不定芽再生不經過或經過很少的愈傷組織階段，這與Ishisarao~報道的蘋果葉片不定芽再生方式相同。此外，Seth等^[6]在研究歐洲李子葉再生過程中發現，IBA 2.5 mg/L與TDZ(5.0、7.5、10.0、12.5 mg/L)配合使用，均能誘導葉片直接再生不定芽，而Barbara等m在研究歐洲李葉片再生過程中發現，TDZ 7.5 mg/L與2.4-D 0.9 mg/L的配合使用。葉片需要經過愈傷組織階段才能誘導不定芽再生。

Tabaeizadeh等^[16]在研究ZT與IAA對番茄葉片再生的影響中發現，適當配比的ZT與IAA配合使用，有助于番茄葉片再生不定芽。Shri等舊研究認為，在鷹嘴豆的葉片再生中單獨使用ZT或者適當配比的ZT與IAA的配合使用，均能有效地提高不定芽再生率。本試驗研究發現，6-BA與IBA的組合不能誘導產生不定芽，而適當配比的ZT與IBA的組合能誘導野生櫻桃李葉片不定芽的直接再生。ZT作為一種較高細胞分裂活性的物質，誘導不定芽再生的效果好于6-BA，其在葉片再生不定芽的過程中具體起著怎樣的調控作用，還需要進一步的研究。

大量研究顯示，光照條件是影響植株不定芽再生的重要因素之一。本試驗研究結果表明，不經過暗培養的葉片不能再生不定芽，說明暗培養是櫻桃李葉片不定芽再生的必要條件，在適當配比的ZT與IBA的作用下。葉片暗培養14 d的不定芽再生效果最好。暗培養少于或多于14 d，再生效果都達不到最佳，這可能與暗培養對葉片的生長發育、形態構成有一定的調控的作用有關，適當的暗培養可能有利于葉片再生不定芽。

4 結論

植物生長調節劑組合IAA 0.4 mg/L+6-BA 0.8mg/L較適于櫻桃李莖段腋芽的萌發與生長培養；正交試驗篩選出不定芽的最佳增殖培養基為3/4MS+IAA 0.5 mg，L+6-BA；1.0 mg/L+蔗糖30 g/L；ZT誘導不定芽再生的效果好于6-BA，ZT 1.5 mg/L+IBA0.05 mg/L為誘導不定芽再生的最適植物生長調節劑組合：暗培養是葉片不定芽再生的必要條件，在最適不定芽再生的培養基上，暗培養14 d的不定芽再生效果最好，野生櫻桃李葉片不定芽再生不經過或經過很少的愈傷組織階段；櫻桃李不定梢的最佳生根培養基為1/2MS+IBA 0.4 mg/L。(本文圖版見封4)