幼胚發育階段對次郎柿胚搶救效果的影響

摘要：迄今對柿幼胚培養的最佳時期尚不完全明確。以完全甜柿品種次郎(1)(ospTros hahi Thunb.cv.Jimu)為試材，探討了幼胚發育階段對胚搶救效果的影響。結果表明，(1)授粉后加d幼胚處于球形胚期，50d處于心形或魚雷形期，60 d之后處于子葉形胚期；(2)接種授粉后40 d幼胚的萌發率(29_3％)顯著低于其它時期，其后不同取胚時期的萌發率均為100％，差異不顯著；(3)接種授粉后60 d幼胚的成苗率(92％)顯著高于具它時期，再生植株苗高和生根數與茛它時期無明顯差異。因此，心形期至子葉期階段是完全甜柿品種次郎幼胚的最佳培養時期，萌發率和成苗率分別為100％和86％-92％。該時期較前人報道的柿幼胚培養時期提早10～20 d。

關鍵詞：次郎甜柿；胚發育階段；胚搶救

胚搶救是克服果樹雜種胚早期敗育的有效途徑，已在早熟桃^[1]、早熟杏^[2]等新品種選育，以及無核葡萄^[3]等新種質創制中廣泛應用。胚搶救技術在利用未減數配子創建無核柿種質^[4]，以及利用單性結實性強的親本(如磨盤柿等)雜交育種^[5]中也具有重要價值。研究表明，柿授粉60 d后胚胎發育已經成熟^[6]。但前人^[5.7-8]報道的柿胚搶救時期為授粉后70 d左右。多年來，我們參考這一時期，采取2n花粉授粉后70 d的次郎幼胚進行胚搶救培養，均未獲得預期9倍體再生植株。其原因可能是胚搶救時期過晚，9倍體合子胚由于染色體不均衡在授粉后70 d以前已經退化^[4]。為此，以我國廣為栽培并常用作育種親本的完全甜柿次郎為試材，首先觀察其授粉后不同時期的幼胚發育階段，然后探討接種不同發育階段幼胚對胚搶救培養再生植物的效果，以期為柿胚搶救技術的有效利用提供科學依據。

1 材料和方法

試材為完全甜柿(P0llination-constant non-as－tringent，PCNA)品種次郎(Diospyros kaki Thunb.cv.Jirou)，授粉品種為禪寺丸(D.kaki Thunb.cv.Zenii-maru)。采自武漢市林業科技推廣站鄭店品種圃(武漢市江夏區鄭店鎮)。

用標簽標記同一天開放的雌花。自授粉后30 d起，每隔10d從幼果中摘取幼胚，在OlympusBH-2型顯微鏡下解剖并觀察幼胚發育情況，并攝影記錄。 采集授粉后40、50、60、70和80 d幼果，參考谷曉峰等^[7]方法在超凈上作臺上取幼胚并接種到附加ZT 0.44 mg/L、IBA 0.3 mg/L、AC 3.0g/L、70.0g/L蔗糖和8.0 g/L瓊脂的MS(1/2N)培養基上。暗培養4 d后轉到恒溫28℃、光照14 h、光照強度31.2-39.0μmol/m²·s條件下培養。每處理接種40-60個胚，重復3次。

幼胚接種1個月后統計萌發率和成苗率，培養6周后測定再生植株苗高和根數。方差分析采用SPSS分析軟件。

2 結果與分析

2.1 胚胎發育階段的觀察

授粉后30 d內在顯微鏡下未觀察到胚。此后觀察到胚的幾個發育時期(圖1)。授粉后40d可見球形胚(圖1-A)；授粉后50 d觀察到一些幼胚處于心-形期，一些幼胚處于魚雷形期(圖1－B，C)，可能是胚個體差異造成幼胚發育階段的不同；授粉后60-80 d胚均為子葉形，其子葉隨著時間延后而長大(圖1-D)。球形期胚很小(

2.2 取胚時期對幼胚萌發率的影響

不同取胚時期影響胚的萌發率(表1)。授粉后40 d幼胚萌發率顯著低于其它時期，未萌發的胚多保持接種時狀態，無分化跡象。球形期以后的胚均可全部萌發，但從接種到萌發所需時間逐漸變短。其中，授粉后40 d幼胚萌發需20 d，且胚生長緩慢，分化的子葉為白色、邊緣皺縮。授粉后50 d幼胚接種10 d后，胚根伸長并分化出根，15 d后子葉和根生長較快，子葉由淡黃轉為綠色。授粉60 d以后幼胚子葉已經形成，其萌發所需時間短，接種5 d后子葉翻卷、1周后胚根向下彎曲分化出根(圖2-A)。之后子葉和下胚軸迅速伸長，子葉顏色由原來的白色變成淡綠色，20 d左右長成完整植株。

2.3 取胚時期對胚成苗率的影響

幼胚萌發后繼續培養可長成完整植株(圖2-B)。不同取胚時期對次郎幼胚培養的成苗率有較大影響(表1)，隨著取胚時期的推后，成苗率逐漸提高。授粉后40 d幼胚。成苗率最低；50、70、80 d齡胚的差異不顯著，成苗率分別為86.3％、85.5％和86.0％：效果最好的是授粉后60 d的胚，成苗率達92％。說明授粉后60 d是最利于成苗的取胚時期。

2.4 取胚時期對胚培苗株高的影響

不同取胚時期對再生植株苗高的影響不顯著(圖3)。萌發的胚在再生培養基上培養1個月后均可長出2-4片真葉，高度在2.0 cm以上，但生長速度不完全一致。5個時期中，授粉后40 d幼胚再生的植株高度最低，平均苗高為2.6 cm，生長速度最慢；授粉后50-80 d胚接種生長較快，平均苗高為3.0 13m左右。其中最高的是授粉后50 d胚。此后繼續培養，再生植株可長出側芽。

2.5 取胚時期對胚培苗生根的影響

暗培養促進幼胚再生植株根的分化。再生植株生根率達80.6％，再生植株根數為7-9條根，最多可達20條以上(圖2－C)。圖4結果可見，授粉后70 d胚平均根數最多，為9，2條，其次為50 d和60 d幼胚。40 d的最少；初生根為白色，生長速度快；1.0 cm以上根為褐色；褐色的根已木質化，較脆，易折斷。少數幼胚再生植株根莖部膨大，大量黑色愈傷組織形成，不利于須根的分化。

3 討論

幼胚接種時期是影響胚搶救效果的關鍵因素之一。Sugoira等^[4]比較次郎授粉后50-170 d胚搶救成苗率未得出胚搶救的適宜時期。Leng等^[9]報道磨盤柿胚培養的最佳時期是授粉后60～80 d。本試驗結果表明，心形期至子葉形期(50-60 DAF)幼胚培養萌發所需時間短，萌發率達到100％，成苗率為86.3％-92％，效果優于其它接種時期。此外，我們對羅田甜柿、磨盤柿和前幾次郎開花后50-60 d幼胚也進行了胚搶救，均獲得較理想的效果(結果未發表)，說明本試驗結果具有較廣的品種適宜性。

胚發育時期存在地域性和時間性差異，胚搶救時期應根據胚的發育階段來確定。本地區次郎授粉后40 d形成球形胚，授粉后50d觀察到心形和魚雷形胚，授粉后60 d直至種子成熟均為子葉形。與鐘云等^[6]研究結果一致。取胚難易直接影響幼胚接種效率。試驗觀察到授粉后40d的球形胚個體小，肉眼難于將其與胚乳區分，不利于完整胚的剝取，影響接種效率。授粉后80 d胚乳開始硬化，取胚時子葉易受機械損傷而折斷。而心形期或魚雷形期胚已經容易辨認。理論上，越早取胚進行胚搶救獲得預期雜種的幾率越大。傳統柿胚搶救時期多在授粉后70 d左右進行^[5.7.8]，這時胚已經完全發育成熟，預期雜種幼胚可能已經發生敗育。因此，綜合考慮，心形期至剛達到子葉彤胚期是柿幼胚搶救的適宜時期。

4 結論

通過系統比較不同發育時期幼胚搶救培養后的幼胚萌發率和成苗率，以及再生植株苗高和根數，認為較好的胚搶救時期是心形期至子葉形胚期階段，這一時期武漢地區為授粉后50～60 d。