歐李‘農大4號’花色苷提取工藝優化及其抗氧化與抑菌作用

杜靈敏，宣曉毛，付鴻博,2，徐豆，郭晉鳴，杜俊杰，王鵬飛，穆霄鵬，張建成*

1(山西農業大學 園藝學院，山西 太谷，030801) 2(黑龍江省農業科學院，鄉村振興科技研究所，黑龍江 哈爾濱，150000)

近年來，隨著人們生活水平的提高和營養保健意識的增強，果實中天然生物活性的研究和開發已成為國內外食品研究和生命科學研究的熱點，如越橘、樹莓、黑穗醋栗、藍莓忍冬和沙棘等果實天然生物活性物質的開發和利用受到國內外學者的廣發關注和青睞[1-3]?；ㄉ站哂幸欢I養和藥理作用，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、心血管保護等生物活性，是一種潛在的功能性著色劑[4]。在食品、化妝品、醫藥領域有巨大應用潛力，是替代合成色素的理想材料，其作為一種天然的、無公害的、綠色環保型食用色素，安全性能極高，無毒，物料來源豐富。

歐李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.) 又稱“鈣果”，是我國特有的薔薇科櫻桃屬多年生小灌木，主要分布于我國的黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、山西等13個省區[5]。歐李果實顏色鮮艷，富含豐富的花色苷色素，具有紅色、紫色或紫黑等多種類型。歐李‘農大4號’果實為紅皮紅肉類型，含有豐富的花色苷色素，但作為我國特有的一種富含花色苷色素的果樹，對果實花色苷色素生物活性研究報道較少。本文研究了歐李‘農大4號’花色苷色素的抗氧化性以及對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用，以期為開發利用歐李花色苷色素與后續功能農業產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

歐李‘農大4號’：于2017年9月，在山西省太谷縣巨鑫試驗基地采摘，作為試驗材料。

供試菌種：大腸桿菌(Escherichia.coli)，由山西農業大學園藝學院歐李團隊提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，購買于中國典型培養物保藏中心。

1.2 試劑

無水乙醇(分析純)，天津市天力化學試劑有限公司；NaOH(分析純)，天津市凱通化學試劑有限公司；乙酸鈉(分析純)，天津市化學試劑三廠；AB-8大孔樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，上海化成工業發展有限公司；30%H2O2(分析純)，天津市天力化學試劑有限公司；FeSO4(分析純)，天津市北辰方正試劑廠；水楊酸(分析純)，天津市北辰方正試劑廠。

1.3 儀器

UV-5200紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；JJ224BC型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；SB25-12D超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；RE-2000B旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；DH系列電熱恒溫培養箱，天津市通利信達儀器廠。

1.4 實驗方法

1.4.1 花色苷含量的測定

采用pH示差法測定，參考LEE等[6]的方法稍作修改。取pH=1.0 KCl-HCl緩沖液和pH=4.5乙酸鈉-鹽酸緩沖液各4.5 mL分別加入到0.5 mL的提取液中，搖勻，平衡15 min，在最大吸收波長520 nm和700 nm下測定吸光值，計算公式如式(1)：

(1)

式中：A=(A520nm-A700nm)pH=1.0-(A520nm-A700nm)pH=4.5；MW=449.2 g/mol；摩爾消光系數ε=26 900 L/(mol·cm)；DF為稀釋倍數；L為光程(cm)；V為提取液體積(mL)；m為原料質量(g)。

1.4.2 歐李‘農大4號’花色苷提取工藝優化

通過4因素(乙醇濃度，料液比，pH值，超聲時間)3水平(乙醇濃度：70%、80%、90%；料液比：1∶5, 1∶6, 1∶7；pH值：1、2、3；超聲時間：10、20、30 min)正交試驗確定歐李‘農大4號’花色苷提取工藝。

1.4.3 歐李‘農大4號’花色苷的制備

稱取一定量的歐李‘農大4號’果實，液氮研磨，按照料液比1∶5加入90%酸化乙醇溶液，超聲提取10 min于10 000×g下離心30 min提取2次，合并上清液，得到粗提液，冷凍干燥得到粗制花色苷粉末。粗提液蒸發濃縮后通過AB-8大孔樹脂吸附至飽和后先用蒸餾水洗至流出液為中性，再用乙醇洗脫，當流出液為無色時洗脫完成，收集洗脫液。洗脫液在40 ℃條件下旋轉蒸發后經冷凍干燥，得到歐李‘農大4號’花色苷粉末，純制品中花色苷含量為13.03 mg/g花色苷粉末。記錄花色苷粉末質量m，根據公式計算提取率。計算公式如式(2)：

(2)

式中：m，花色苷質量，g；m0，果實質量，g。

1.4.4 樹脂的預處理

將AB-8大孔樹脂用4%的NaOH溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性；再用4%的HCl浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性；最后用體積分數有95%乙醇浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性，備用(此處中性以流出液的pH來判斷)[6]。

1.4.5 歐李‘農大4號’花色苷抗氧化實驗

1.4.5.1 DPPH·清除率的測定

參照文獻方法并稍作改動[7]。將提取液稀釋適宜倍數后，取2.8 mL的DPPH·溶液，加入0.2 mL稀釋后的提取液，充分振蕩混合，室溫避光反應30 min，與517 nm下測定吸光度，記做A1，空白為加入0.2 mL的體積分數為90%乙醇溶液，測定吸光度記做A2，每個樣品平行測定3次。按公式(3)計算DPPH·的清除率。

(3)

1.4.5.2 FRAP還原力測定

將提取液稀釋至適宜濃度后，取0.1 mL稀釋液，加入4.9 mL FRAP試劑，避光反應10 min后在593 nm下測定吸光值，0.1 mL的體積分數為90%乙醇作為空白對照，每個樣品平行測定3次[8]。

1.4.5.3 ·OH清除率的測定

(4)

1.4.6 歐李‘農大4號’花色苷抑菌性實驗

1.4.6.1 敏感性實驗[10]

采用牛津杯法。將滅菌的培養基倒入平板，凝固后將0.2 mL的菌懸液均勻涂布于培養基上，每個培養皿中均勻放入3個牛津杯，其中2個牛津杯中加0.1 mL一定濃度的歐李‘農大4號’花色苷純化液；另一個牛津杯加0.1 mL無菌水作對照。置于恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，通過抑菌圈判斷抑菌效果。

1.4.6.2 最小抑菌濃度測定

取歐李‘農大4號’花色苷粉末，用一定無菌水稀釋后后，采用二倍稀釋法加入培養基中，然后將稀釋后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種于各培養基中，分別于37 ℃培養箱內恒溫培養24 h，以出現透明抑菌圈的最低稀釋濃度為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。

1.4.6.3 高溫處理對歐李‘農大4號’花色苷的抑菌效果的影響

根據MIC配制花色苷溶液，分別于40、60、80、100 ℃下處理30 min，加入到對應的菌液中，以未經熱處理(25 ℃)的花色苷溶液作對照。在0、2、4、6、8、12、20 h取樣，測OD600值，計算抑菌率。

1.5 統計分析

采用Excel軟件進行數據計算和作圖，采用SAS 8.0和SPSS 20.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 歐李‘農大4號’花色苷提取條件

采用4因素3水平正交試驗(L9(34))，確定最佳提取條件。正交試驗因素水平見表1。

經極差分析(見表2)可知，RA>RC>RB>RD，因此，影響提取量大小的因素依次為：A>C>B>D，即乙醇體積分數>pH>料液比>超聲時間。由圖1正交試驗因素水平直觀分析圖可以看出，優選方案為A3B1C2D1,即乙醇體積分數90%，料液比1∶5，pH值2.0，超聲時間10 min。由于這個組合在以上9組試驗中沒有出現，因此，進一步試驗，得到該處理下提取量為24.21 mg/100 g， 高于以上9組試驗。因此，確定最終提取條件為乙醇體積分數為90%(pH=2.0)，料液比1∶5，超聲時間為10 min。由表3方差分析可見，因素A、B、C對花色苷提取量的影響極顯著(P<0.01)。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment

圖1 正交試驗因素水平直觀分析圖Fig.1 Direct observation analysis figure of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance components of orthogonal test

變異來源(S.V)自由度(df)平方和(SS)均方(MS)FPr>FA2207.432103.716120.558<0.01B233.78016.86019.633<0.01C256.40318.20132.781<0.01D23.2851.6431.909>0.05誤差1815.4850.860總和26316.386

注：P<0.05表示差異達顯著水平，P<0.01表示差異達極顯著水平。

2.2 歐李‘農大4號’花色苷提取

稱取72.00 g歐李‘農大4號’果實，通過超聲，冷凍離心，AB-8大孔樹脂吸附，真空冷凍干燥等工藝，得到深紅色粉末0.48 g，提取率0.67%。

2.3 歐李‘農大4號’花色苷抗氧化能力

由圖2可知，歐李‘農大4號’花色苷粗提液DPPH·清除力、FRAP還原力、·OH清除力的TEAC值分別為32.66、24.38、9.59 mg/g花色苷；歐李‘農大4號’花色苷純化液DPPH·清除力、FRAP還原力、·OH 清除力的TEAC值分別為35.47、33.33、12.01 mg/g花色苷。歐李‘農大4號’花色苷純化液的DPPH·清除力、FRAP還原力、·OH清除力顯著高于粗提液。

圖2 歐李‘農大4號’花色苷粗提液與純化液抗氧化能力比較Fig.2 Compare antioxidant activity of anthocyanins the crude product and the refined product from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’注：不同小寫字母表示差異顯著。

歐李‘農大4號’花色苷粗提液DPPH·清除力顯著高于FRAP還原力和·OH清除力；歐李‘農大4號’花色苷純化液DPPH·清除力顯著高于FRAP還原力和·OH清除力。因此，歐李‘農大4號’花色苷的抗氧化能力從高到低依次是：DPPH·清除力>FRAP還原力>·OH清除力。

2.4 敏感性試驗

由圖3可知，歐李‘農大4號’花色苷提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。

A-大腸桿菌；B-枯草芽孢桿菌；C-金黃色葡萄球菌圖3 歐李‘農大4號’花色苷抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’

2.5 最小抑菌濃度(MIC)

由表4可知，對于不同菌種，花色苷對其抑制效果不一樣。歐李‘農大4號’花色苷對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別是1 040、520、130 μg/mL。

表4 歐李‘農大4號’花色苷最小抑菌濃度(MIC)測定結果Table 4 MIC of anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on different microorganisms

注:“+”表示有抑菌圈；“-”表示無抑菌圈。

2.6 高溫處理對歐李‘農大4號’花色苷抑菌效果的影響

由圖4～圖6可知，歐李‘農大4號’花色苷提取液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌在短時間內抑菌率達到最高，隨時間的延長呈下降的趨勢，總體呈現先上升后下降的趨勢。在相同的作用時間內，歐李‘農大4號’花色苷提取液對60 ℃以上的高溫較敏感，在高溫下易被破壞，抑菌效果隨溫度的升高而下降。

圖4 高溫處理歐李‘農大4號’花色苷對抑制金黃色葡萄球菌的影響Fig.4 Inhibitory effect of temperature on anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on Staphlococcus aureus

圖5 高溫處理歐李‘農大4號’花色苷對抑制枯草芽孢桿菌的影響Fig.5 Inhibitory effect of temperature on anthocyanins fromthe Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on Bacillus subtilis

圖6 高溫處理歐李‘農大4號’花色苷對大腸桿菌抑制率的影響Fig.6 Inhibitory effect of temperature on anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on Escherichia.coli

3 討論

歐李花色苷為水溶性色素，在醇溶液和水溶液中溶解性都比較好，本試驗選用酸化乙醇溶劑進行提取?；ㄉ赵谒峄瘲l件下較為穩定，因此，提取過程通常采用酸化乙醇溶液。酸化乙醇溶液在破壞植物細胞膜的同時溶解花色苷，可提高花色苷的提取率[11]。大量花色苷提取方法表明，植物花色苷的提取率受乙醇濃度、pH值、料液比、超聲時間的影響[12-15]。這與本試驗從乙醇體積分數、料液比、pH值、超聲時間4個方面確定最優提取工藝一致。

果實中的花色苷除作為天然色素外，還具有很強的抗氧化、清除自由基的能力，是一種具有保健功能的天然生理活性物質。雷月等[16]研究表明，藍靛果粗制及精制花色苷具有較強的還原能力、清除DPPH·、·OH的能力，且花色苷的精制品的抗氧化能力明顯強于粗制品。劉敬華等[17]研究表明，藍靛果高純度花色苷在抗氧化性、穩定性方面比精制花色苷更好。張澤生等[18-19]從葡萄皮提取的花青苷能有效清除DPPH·、·OH，尤其對·OH的清除能力強于抗壞血酸。LINDA等[20]檢測了12種可食用的果實，發現其中9種果實的半提純成分表現出高的抗氧化性，在半提純部分檢測到了花青素-3-葡萄糖苷和飛燕草色素-3-葡萄糖苷。本實驗對歐李‘農大4號’花色苷粗提液及純化液進行DPPH·、·OH、FRAP還原力的測定，結果顯示純化液的抗氧化能力性強于粗提液，并且抗氧化能力從高到低依次為DPPH·清除力>FRAP還原力>·OH自由基清除力。

近年來對花色苷的抑菌性有很多研究報道。蔣麗施等[18]對紫薯花色苷抑菌作用的探究表明，紫薯花色苷對傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌有明顯的抑菌效果且高溫處理會是紫薯花色苷的抑菌作用減弱。申杰等[21]研究表明楊梅花色苷提取物對灰莓葡萄孢有抑制作用，且55 ℃處理30 min和90 ℃處理15 min 能使花色苷提取物的抑菌率下降。本實驗進行了歐李‘農大4號’花色苷提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果的研究，結果表明，歐李‘農大4號’花色苷對以上3種菌有較強的抑制效果。經花色苷作用后的Escherichia.coli和Staphylococcusanreusaureus菌體出現質壁分離，細胞質稀薄，菌體解體成空泡、菌體細胞溶解死亡，這表明花色苷能夠影響細胞壁的通透性[22]。王關林等[23]對中藥抑菌研究中曾報道，皂苷類化合物與蛋白結合成復合物的作用，從而影響了細胞生物膜的通透性。花色苷屬苷類物質可能有同樣的作用機理。歐李‘農大4號’花色苷對60 ℃以上高溫較敏感，抑菌率隨溫度上升而下降。高溫處理可能破壞了花色苷的功能結構，使其抑菌效果降低。