ＲＮＡ干擾對人瘢痕疙瘩成纖維細胞ＣＴＧＦ表達和膠原合成的影響

[摘要]目的：研究結締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）siRNA表達載體對瘢痕疙瘩成纖維細胞（Human keloid fibroblasts，HKFs）中CTGF表達、膠原蛋白分泌的影響。方法：根據RNA干擾(RNA interference， RNAi)設計原則，設計并構建特異性CTGF siRNA表達載體，轉染體外培養HKFs。用熒光實時定量PCR分析細胞中CTGF mRNA表達水平，3H-脯氨酸摻入法測定細胞膠原蛋白分泌水平。結果：與質粒組和對照組比較， CTGF siRNA表達載體組的CTGF mRNA表達降低約59.9%（P＜0.05），膠原蛋白分泌明顯下降（P＜0.05）。結論： CTGF siRNA表達載體能明顯抑制HKFs中CTGF表達及膠原蛋白分泌水平，有可能成為臨床上治療瘢痕疙瘩的新方法。

[關鍵詞]基因療法；結締組織生長因子；人瘢痕成纖維細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-03

Impact of RNAi on CTGF expression and collagen secretion in HKFs

ZHAO Ping，LI Shi-rong

（Department of Plastic Surgery， Southwest of Third Military Medical University， Chongqing400038，China）

Abstract:ObjectiveTo study the effect of the constructed vecrors expressing siRNA of connective tissue growth factor(CTGF) on CTGF mRNA level and collagen secretion in HKFs.MethodsVectors expressing CTGF siRNA were designed， constructed andtransfected into HKFs. The real-time fluorescent quantitative PCR（RQ-PCR）was performed to detect CTGFmRNA level. The collagen secretion was assessed by 3H-proline incorporation method.ResultsThe CTGFmRNA level and the collagen secretion of vecrors group were markedly lower than those of plasmids group（both P＜0.05）.ConclusionVectors expressing CTGF siRNA can inhibit CTGFmRNA level and the collagen secretion in HKFs. This may be a new way to treat keloid.

Key words: gene therapy；Connective tissue growth factor(CTGF)；HKFs

瘢痕疙瘩（Keloid KD）是皮膚損傷如創傷、燒傷或手術后引發的以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的過度瘢痕化。其發病機理尚不十分清楚，常嚴重毀損患者容顏，引發功能障礙，是整形外科領域的治療重點和難點。CTGF是一種重要的促纖維化因子，通過TGF/SMADs途徑參與病理性瘢痕的形成，阻斷CTGF的產生及其促纖維化效應可能為今后病理性瘢痕的治療提供了一個新的靶點[1]。本研究旨在構建CTGF siRNA表達載體，轉染導入HKFs中，觀察其對細胞內CTGF的表達和膠原蛋白分泌的影響，并探討有關機制，為臨床上防治瘢痕疙瘩提供新的途徑。

1資料和方法

1.1 主要試劑：質粒pGenesil-1（武漢晶賽生物公司），Dosper脂質體（Roche，德國），DMEM高糖培養基（Gibco，美國），Trizol試劑、SYBRGreenⅠ熒光染料、RT-PCR試劑盒(Invitrogen，美國)，3H-脯氨酸（上海原子能研究所）。

1.2 CTGF siRNA表達載體的構建和鑒定：根據RNAi設計原則，用生物信息學方法在GeneBank中找到CTGF基因編碼序列(登錄號:NM_001901)，選擇編碼區內以起始密碼ATG后100bp始至終止密碼前100bp止的一段序列作為候選區，輸入在線設計網站http://www.ambion.com，尋找出的序列再經BLAST比對。最后將篩選出的3條序列分別設計3對64nt寡核苷酸，送上海生工合成。每條寡核苷酸包括：兩端用于形成酶切位點（BamHI和HindIII）的序列，作為終止信號的5個胸嘧啶核苷(T)，兩個反向互補排列的21ntCTGF特異性序列由一個9nt的間區隔開，用于形成莖環結構。將寡核苷酸退火結合形成雙鏈，將環狀質粒pGenesil-1用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠回收大片段。將退火片段與線性化載體進行連接，構建CTGF siRNA表達載體，酶切及測序鑒定正確后轉染細胞，篩選出抑制效率最高的靶序列AAAGTGCATCCGTACTCCCAA。

1.3 細胞培養：選用瘢痕疙瘩患者（診斷標準參見文獻[2]）術中切除的瘢痕組織，于無感染及潰瘍處取材，組織法分離HKFs，加入10%小牛血清的DMEM培養基，培養條件為37℃ 5%CO2，待細胞融合后，0.25%胰酶溶液消化并按1:3傳代，傳代后細胞均勻接種，取體外培養第5代細胞用于實驗。

1.4基因轉染

1.4.1 實驗分組：對照組:單純DMEM培養基+脂質體；空質粒組：轉染pGenesil-1空質粒；表達載體組：轉染CTGF siRNA表達載體。

1.4.2基因轉染

1.4.2.1 制備空質粒（表達載體）+脂質體復合物：采用無血清、無抗生素的DMEM培養液分別稀釋空質粒（表達載體）和Dosper脂質體，室溫下靜置30min后等量混勻形成復合物。

1.4.2.2 轉染：用0.25%胰酶消化單層培養細胞，以含10%小牛血清的DMEM培養液配成單細胞懸液，將細胞以3×106/ml的密度接種于25cm2細胞培養瓶孔板。在37℃ 5%CO2的飽和水汽培養箱中培養至70%～80%融合時根據實驗分組轉染細胞，繼續培養至預定時相點。

1.5HKFs中CTGFmRNA的測定

1.5.1 總RNA提取：收集細胞，以Trizol試劑提取總RNA，于波長260、280nm處測定吸光度（A）值，計算核酸純度A260/A280為1.8～2.0，置-70℃保存備用。

1.5.2 逆轉錄反應：反應條件為30℃10min、60℃25min、99℃5min、5℃ 5min。

1.5.3 實時熒光定量PCR檢測：Primer5.0軟件設計CTGF引物序列，正向為5'-CCCGCAGTGCCAACCATGAC -3'，反向為5'-GCAGCCGCAGCCGTCCAG-3'，擴增片段長度為184bp；內參三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物序列正向為5'-CGCGGGGCTCTCCA -GAACAT-3'，反向為5'-CTCCGACGCCTGCTTCACCA-3'，擴增片段長度為204bp。反應過程為94℃預變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共循環28次，72℃延伸10min。SYBRGreenⅠ熒光染料技術行實時定量PCR反應，同樣樣本做3復管，ABI7500 熒光定量PCR儀檢測，計算機分析ΔCt值:每個反應管內熒光強度達到系統所能檢測到的域值時所經歷的循環數-內參的循環數。

1.6 HKFs的膠原含量的測定：于各組細胞中加入含有0.5μCi的H3-脯氨酸溶液10μl，維生素C、β氨基丙啨混合液100μl，每組設5個復孔，繼續培養24h。以多頭細胞收集器收集樣本并干燥，經閃爍液處理后送液體閃爍計數儀檢測。

1.7統計學處理：采用SPSS10.0統計軟件包，實驗計量結果采用以x±s表示。

2結果

2.1 CTGF siRNA表達載體對HKFs中CTGFmRNA表達的影響：定量結果顯示，表達載體組的CTGFmRNA表達含量較空質粒組減少約59.9%（P＜0.05）；對照組和質粒組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 CTGF siRNA表達載體對HKFs膠原分泌的影響：表達載體組對HKFs的膠原分泌較空質粒組和對照組有明顯抑制作用（P＜0.05），質粒組和對照組間差異無統計學意義（△P＞0.05）。見表2。

3討論

RNA干擾是一種轉錄后基因沉默機制，即mRNA被結合后即被降解或被相應的反義RNAP蛋白質封閉，從而阻止mRNA修飾和翻譯，這種RNA水平的基因調控比轉錄水平基因沉默現象更普遍[3]，具有特異性、高效性和方便性等顯著特點。Takabatake等[4]就證明RNA干擾抑制基因表達的效果比反義寡核苷酸技術效率高1000倍以上。

人GTGF屬于CNN（即刻早期基因）家族成員，其生物學效應主要表現在促進細胞有絲分裂和增生，誘導細胞黏附和凋亡，調節細胞外基質合成，誘導血管形成、軟骨骨化和促進胚胎發育等諸多方面[5]。在皮膚纖維化方面，Colwell等[6]研究發現，在瘢痕疙瘩成纖維細胞中，結締組織生長因子(CTGF)的表達比正常皮膚組織中提高約20倍，并且經TGF-β1刺激后，CTGF的表達可提高100倍以上，認為TGF-β1可能通過CTGF表達的提高促使瘢痕疙瘩的形成，而阻斷CTGF的活性則可以減少病理性瘢痕的發生。而劉劍毅等[7]在脂質體介導下，將異硫氰酸熒光素標記的硫代磷酸化CTGF反義寡核苷酸轉染至體外培養的HKFs中，結果發現CTGF反義寡核苷酸能夠抑制HKFs的CTGF mRNA的表達和膠原合成。

許多實驗已證實通過靶向抑制CTGF從而抑制纖維化的發生發展是理論上抗纖維化的有效形式，由于siRNA表達載體成功轉染后可進行瞬時或穩定的基因沉默，因此相較于化學合成更有應用價值。

在本實驗中，我們構建了特異性的CTGF siRNA表達載體，轉染入瘢痕成纖維細胞。證實轉染表達載體的瘢痕成纖維細胞的CTGFmRNA表達水平顯著降低，與空質粒組相比，抑制效果十分明顯，膠原蛋白分泌量相比也明顯減少。提示莖環樣結構的CTGF siRNA表達載體可在細胞內經Dicer酶切割自動加工成為siRNA分子， 特異性地與CTGFmRNA相結合， 降解CTGFmRNA，引發基因沉默或表達抑制，同時導致細胞外膠原分泌降低。這可能為臨床上治療瘢痕疙瘩提供了新方法。

［參考文獻］

[1]曹廣信，王維精. CTGF與病理性瘢痕關系研究進展[J].中國美容醫學，2006，15(10): 1211-1213.

[2]鮑衛漢. 實用瘢痕學[M].北京：北京醫科大學出版社，2000：338-339.

[3]Leirdal M， Sioud M. Gene silencing in mammalian cells by performed small RNA duplexes[J]. Biochem Biophys RES Commun， 2002， 295:744-748.

[4]Takabatake Y， Isaka Y， Mizui M， Kawachi H， et al. Exploring RNA interference as a therapeutic strategy for renal disease[J]. Gene Ther， 2005，12(12):965-73.

[5]高 云，楊松林. 結締組織生長因子與病理性瘢痕[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11(23): 4606-4609.

[6] Cohen L， Zhang K， Garner W， et al. Increased types Ⅰ and Ⅲ collagen and transforming growth factor-β， mRNA and protein in hypertrophic burn scar[J]. J Invest Dermatol， 1995，104:750-754.

[7]劉劍毅，李世榮，紀淑興，等. 反義寡核苷酸對人K成纖維細胞CTGF基因表達和膠原合成的作用[J].中華燒傷雜志，2004，20(2): 72-75.

[收稿日期]2008-02-13[修回日期]2008-04-20

編輯/張惠娟