骨髓間充質干細胞對豚鼠皮膚光老化治療作用的研究

[摘要]目的：探討骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）皮膚光老化的修復作用，為皮膚光老化的治療提供新的治療途徑。方法：UVA，UVB紫外線燈同時照射豚鼠，每天2h，連續照射50天，制備皮膚光老化模型；紫外線照射2周后，在豚鼠皮膚照射區，局部多點皮內注射DAPI標記的第3代豚鼠BMSCs 0.8ml（1×105個/ml），每周一次。注射后24h、5天及10天觀察豚鼠皮膚變化，同時取照射區的皮膚制備冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察DAPI標記的BMSCs在紫外線照射區皮膚組織內的遷徙及定居情況。結果：與對照組相比，隨照射時間的延長，未治療組皮膚光老化癥狀逐漸加深，出現皺紋，皮膚松弛、修復性增厚，皮屑，色素沉積，皮革樣外觀；BMSCs治療組在治療前出現的癥狀與未治療組相同，治療后上述癥狀逐漸消失，未出現色素沉著。激光共聚焦顯微鏡下觀察，注射后24h，BMSCs出現在真皮層；注射后5天BMSCs出現在真皮層以及毛囊等組織；注射后10天廣泛彌散在皮膚各層，包括角質層。結論：BMSCs對皮膚光老化有明顯的延緩及修復作用。

[關鍵詞]皮膚光老化；骨髓間充質干細胞；激光共聚焦顯微鏡

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）05-03

Research of bone marrow mesenchymal stem cells curing photoaging of guinea pig skin

YAO Chun-li，SU Guan-fang

(Department of Laser Cosmetics and Plastic Surgery ofthe 2rd Hospital of Jilin University， Jilin 130041， Changchun，China)

Abstract：ObjectiveTo research bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) curing photoaging of guinea pig skin to provide a new way of curing skin photoaging.MethodsIrradiated guinea pigs 2 hours per day for 50 days using UVA and UVB ultraviolet radiator to establish skin photoaging model.After 2 week radiation executed multiple intradermal injections of the third-generation BMSCs(0.8ml，1×105/ml) marked by DAPI into the ultraviolet radiation area of guinea pig skin every week.Observed the skin 24h，5d and 10d after injection，and maked frozen section from the ultraviolet radiation area of guinea pig skin.Observed migration and ecesis of the BMSCs marked by DAPI in ultraviolet radiation area of guinea pig skin by laser scanning confocal microscope.ResultsCompared with control group，skin photoaging symptoms of the no-treatment group increased with irraditive time，wrinkles， cutis laxa，scurf reparativethickening，pigment deposition and leather appearance appeard.The same symptom of the treatment group gradually dissappered and no pigment deposition appeard in the treatment group.Using laser scanning confocal microscope the BMSCs marked by DAPI were observed appearing in dermis 24h after the injection，appearing in dermis，hair follicle，etc，5d after the injection，becoming dispersedly distributed in the entire layers of the skin including stratum corneum 10d after the injection.ConclusionBMSCs could obviously delay and cure skin photoaging.

Key words: skin photoaging; bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs);laser scanning confocal microscope

Ei-Domyati M等[1]研究發現，在日光保護部位，皮膚Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原只有到80歲以后才表現出減少，但在日光曝露部位10歲時已減少20%左右，到90歲時減少50%左右，而且曝露部位的膠原纖維結構在40歲后出現紊亂。而Fathke C[2]研究證實，損傷的皮膚是BMSCs的靶組織，BMSCs能夠縮短I型和III型膠原的轉錄，BMSCs治療皮膚創傷的作用比公認的CD45+細胞亞群的作用更大。但BMSCs用于治療皮膚光老化未見報道。因此，本研究在皮膚光老化模型豚鼠紫外線照射區皮內局部注射DAPI標記的BMSCs，觀察BMSCs細胞在光老化皮膚內遷徙、定居以及對光老化組織的修復作用，為皮膚光老化的預防和治療提供理論依據和實驗數據。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：DMEM（ScienCell，美國），胎牛血清（Hyclone公司，美國），二甲基亞砜、DAPI（Sigma公司，美國）；倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本），15W UV-A和UV-B紫外燈（上海晨辰照明電器有限公司）。

1.2 實驗動物與分組：健康雌性白色豚鼠，體重（220±20）g，30只，購自吉林大學醫學院實驗動物中心。皮膚光老化模型豚鼠20只，隨機分為2組：未治療組（單純紫外線照射），治療組（紫外線照射2周后，局部多點皮內注射0.8ml豚鼠BMSCs （1×105個/ml），每周一次）。另取正常豚鼠作為對照。BMSCs注射后24h、5天、10天，觀察BMSCs對紫外線照射區皮膚的治療作用。

1.3 皮膚光老化動物模型的建立：用剪毛剪剪除5cm×5cm區域的豚鼠背部毛，將15w UV-A和UV-B紫外燈并列置于豚鼠背部裸露皮膚區正上方35cm處，每天照射2h，每天用剃須刀剔除新長出的豚鼠毛，觀察豚鼠皮膚變化。

1.4 豚鼠BMSCs的體外分離培養：處死豚鼠乳鼠，75%酒精浸泡，無菌條件下取股骨和肱骨，用DMEM培養液反復沖洗骨髓腔，用200目濾網過濾，制成單細胞。加入等體積的percoll分離液，1500r/min離心20min，吸取單個核細胞層加入DMEM培養液，1 200r/min離心8min，洗滌細胞，反復2次。計數，以(4±2)×106個/ml細胞接種于培養瓶中，加入含15%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液，置于37℃，5%CO2培養箱中，每周換液2次。待細胞達80%～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，傳到3代備用。

1.5 DAPI標記的BMSCs對豚鼠皮膚光老化的治療：稱取DAPI 5.0mg，溶于1.427ml二甲基亞砜（DMSO）中，再加入713ml DMEM，混勻，作為DAPI應用液備用。收集培養第3代的豚鼠BMSCs，用DMEM洗滌2次，加入DAPI應用液10ml/瓶，置于37℃，5%CO2培養箱中，1h后，棄去DAPI應用液，用DMEM洗滌2次，加入含15％胎牛血清的DMEM，繼續培養。24h后，熒光顯微鏡下觀察細胞，確認標記成功后，收集細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml。紫外線照射2周后，在豚鼠皮膚照射區局部多點皮內注射0.8ml上述細胞。注射后24h、5天、10天觀察照射區皮膚變化，并處死豚鼠，取紫外線照射區的皮膚制備冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察DAPI標記的BMSCs的分布。

2結果

2.1 BMSCs對豚鼠皮膚光老化的治療作用：在豚鼠紫外線照射區，局部多點皮內注射DAPI標記的第3代豚鼠BMSCs，肉眼觀察可見，對照組皮膚無明顯變化；與對照組相比，隨照射時間的延長，未治療組皮膚光老化癥狀逐漸加深，出現皺紋，皮膚松弛、修復性增厚，皮屑，色素沉積，皮革樣外觀（圖1）；BMSCs治療組在治療前出現的癥狀與未治療組相同，治療后皺紋、皮膚松弛、修復性增厚、皮屑等癥狀逐漸消失，未出現色素沉著（圖2）。

2.2 DAPI標記的BMSCs在紫外線照射區豚鼠皮膚組織內的遷徙和定居：將DAPI標記的BMSCs經皮膚紫外線照射區局部多點皮內注入后，取紫外線照射區的皮膚制備冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察，注射后24h，BMSCs出現在真皮層；注射后5天BMSCs出現在真皮層以及毛囊等組織；注射后10天廣泛彌散在皮膚各層，包括角質層，如圖3示。

3討論

BMSCs具有：①來源相對廣泛、取材方便；②低免疫源性，并可進行自體移植，大大降低了免疫排斥危險；③易于擴增（MSC可擴增達20代[3-4]）；④具有良好的可塑性，在損傷信號的誘導下能夠分化為各種神經細胞；⑤具有對病變部位的“趨化性”等優點。因此被用于治療皮膚損傷。大量研究結果表明，BMSCs在皮膚損傷中的應用都取得了理想效果，含有BMSCs 的組織工程皮膚移植后促進了燒傷創面的愈合[5]，復合BMSCs的組織工程真皮移植后，提高了愈合速度，獲得了較理想的創面愈合效果[6]。但是應用BMSCs治療皮膚光老化未見報道。皮膚光老化是皮膚衰老的一部分，對其預防與治療，可以提高人們的生命質量。

因此，本研究模擬自然光線，建立豚鼠皮膚光老化模型，研究BMSCs對皮膚光老化的作用，以探索預防與治療皮膚光老化的新途徑。結果顯示，與對照組相比，隨照射時間的延長，未治療組皮膚光老化癥狀逐漸加深，出現皺紋，皮膚松弛、修復性增厚，皮屑，色素沉積，皮革樣外觀；BMSCs治療組在治療前出現的癥狀與未治療組相同，治療后，皺紋、皮膚松弛、修復性增厚、皮屑等癥狀逐漸消失，未出現色素沉著。激光共聚焦顯微鏡下觀察，注射后24h，BMSCs出現在真皮層；注射后5天BMSCs出現在真皮層以及毛囊等組織；注射后10天廣泛彌散在皮膚各層，包括角質層。結果提示BMSCs延緩皮膚光老化，對皮膚光老化有修復作用。BMSCs對皮膚光老化治療作用的機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]Ei-Domyati M， Attia S， Saleh F， et al. Intrinsic aging vs.photoaging: a comparative histopathological， immnohisto-chemical， and ultrastructural study of skin[J]. Exp Dermtol，2002， 11(5) : 398-405.

[2]Fathke C，Wilson L，Hutter J，et al.Contribution of bone marrow derived cells to skin:collagen deposition and wound repair[J].Stem Cells，2004，22（5）:812-822.

[3]Rubio D， Garcia Castro J， Martin MC， et al. Spontaneous human adult stem cell transformation[J]. Cancer Res，2005，65(8):3035-3039.

[4]袁 源，王媛麗，楊樹源，等.人臍帶間質干細胞分離純化及基本生物學特性研究[J].青島大學醫學院學報，2006，42(2):120-122.

[5]劉 鵬， 鄧志宏， 溫 寧， 等. 復合骨髓間充質干細胞的組織工程皮膚修復燒傷創面的實驗研究[J]. 中國美容醫學，2007，16(4)：437-439.

[6]張兆清，余春艷，金 巖，等. 復合骨髓間充質干細胞的組織工程皮膚治療慢性難愈性潰瘍探討[J]. 中國皮膚性病學雜志，2006， 20(4)：211-213.

[收稿日期]2008-01-09[修回日期]2008-03-15

編輯/張惠娟