豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

摘要：昆明市某豬場的仔豬群中發生一起以敗血癥為主要特征的急性傳染病。從該豬場可疑病料中分離出1株豬源致病性鏈球菌，開展了形態學、培養特性、生化特性、血清學鑒定等試驗對其進行了鑒定，并進行了豬鏈球菌的動物致病性試驗和藥敏試驗。結果表明：此分離菌株為豬鏈球菌2型；對小鼠有很強的致病性；頭孢噻呋、阿莫西林、頭孢他啶、氧氟沙星、氨芐青霉素等對分離菌株高敏。

關鍵詞：豬；鏈球菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號：S828；S852.61 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X(2008)05-0007-02

豬鏈球菌病(Swine streptococcus)是危害養豬業的一種常見傳染病，在臨床上可分為敗血癥型、腦膜炎型、關節炎型、淋巴結膿腫型等。哺乳仔豬和剛斷乳仔豬發病主要以敗血癥型、腦膜炎型為主，發病率和死亡率均較高。肥育豬發病多以關節炎或淋巴結膿腫為特征，其死亡率較低，但影響生長發育，給養豬業造成巨大的經濟損失。

2006年9月，昆明市某豬場飼養的30頭20d左右的哺乳仔豬突然發病，主要表現為體溫升高(41.0℃以上)，嗜睡，拒絕吮乳，呼吸急促，部分患豬耳尖、四肢下端有出血性紅斑，排黃色稀糞。剖檢可見腹部皮下組織明顯出血，腹股溝淋巴結出血，肺充血、出血，胸腔積液，脾腫大呈暗紅色，腎臟可見少量針尖樣出血點。該場雖然采用了青霉素鏈霉素等一些常用的抗菌藥物進行治療，但病情未見明顯好轉。為了有效地控制該病的發生從病原學著手研究，從該豬場可疑病料中分離細菌，開展了形態學、培養特性、生化特性、血清學鑒定等試驗對其進行了鑒定，并對其進行了動物致病性試驗和藥敏試驗，以便為控制該病提供理論依據，現將有關情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病料采自該豬場的發病仔豬的脾臟、淋巴結；微量生化管購于昆明貝爾吉科技有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司，紙片直徑為6.35mm±0.05mm；鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒由云南省獸醫衛生防疫站提供；豬鏈球菌2型陽性血清由南京農業大學提供；小白鼠由昆明醫學院實驗動物中心提供。

1.2 細菌學檢查

將病料涂抹于普通瓊脂平板和鮮血瓊脂平板(含5％兔脫脂血)上。37℃溫箱培養24h，涂片，革蘭氏染色后鏡檢。將鏡檢中發現有革蘭氏陽性成雙或短鏈狀的菌落接種于馬丁瓊脂平板和血清瓊脂平板上，37℃培養24h，挑取平板上單個可疑菌落染色鏡檢。再接種于含0.2％葡萄糖、1％犢牛血清的THB培養基中做增菌培養，37℃溫箱純培養24h。

1.3 生化及生長試驗

將分離出的純培養菌株接種在血清瓊脂培養基上，37℃培養24h后，取血清瓊脂平板上發生溶血的典型菌落進行各種常規生化試驗和鑒別生化試驗；分別接種于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、木糖、山梨醇、菊糖等培養基上觀察是否產酸：6.5％NaCl、七葉苷、馬尿酸鈉、明膠液化、pH 9.6肉湯培養試驗等，記錄各種生化試驗結果。將分離菌株分別接種在上述培養基中，分別培養在10℃、45℃進行生長試驗。

1.4 動物致病性試驗

用分離的鏈球菌24h THB純培養菌株。注射5只小白鼠，每只小白鼠腹腔注射0.2mL，另設5只小白鼠分別腹腔注射0.2mL生理鹽水作對照，所用小白鼠均為22g左右。觀察小白鼠發病及死亡情況。并對死亡小白鼠進行細菌分離。

1.5 溶血試驗

采用平板法(PA)：將鏈球菌接種于含有5％兔鮮血平板。37℃培養24h后觀察，菌落周圍出現明顯溶血環者判為溶血陽性。

采用接觸法(CH)；將各菌株接種于THB培養基，37℃靜止培養24h后，取50μL菌液在“V”形96孔微量滴定板上倍比稀釋后，與等體積1％兔紅細胞混合，37℃作用1h后觀察結果。

1.6 乳膠凝集試驗

按鏈球菌乳膠凝集標準診斷試劑盒說明書的方法進行。將待檢分離菌株接種于血清瓊脂培養基，經過37℃培養18～24h，選取2～3個菌落，在0.4mL專用提取酶中，混勻后放37℃溫箱中乳化10～15min。分別與試劑盒蘭氏分群A-G的乳膠診斷試劑作凝集試驗，并設PBS空白對照。

1.7 玻片凝集試驗

將待檢分離菌株用結晶紫染色后，按常規方法用豬鏈球菌2型標準陽性血清作玻片凝集試驗，試驗中以生理鹽水為陰性對照。

1.8 藥敏試驗

按常規紙片擴散法進行試驗。將分離的鏈球菌24h THB培養基純培養菌株，用滅菌生理鹽水10倍稀釋后，振蕩器上震蕩，制成細菌混懸液，在無菌條件下，先用已滅菌細管吸取0.2mL于血清瓊脂平板上，再用滅菌的玻璃棒盡可能涂布均勻，加蓋后放置幾分鐘。待平板稍干后，然后將藥敏紙片用無菌鑷子將其貼在己接種被檢菌株的平板上，并輕壓藥敏紙片使其緊貼培養基表面。每個平板貼4～5張藥敏紙片，兩片之間的距離以2～3cm為宜，使紙片間距最大。置于37℃溫箱培養18～24h觀察結果并記錄。結果判定標準：抑菌圈直徑15mm以上為高度敏感，抑菌圈直徑10-15mm為中度敏感，抑菌圈直徑10mm以下為耐藥間。

2 結果與分析

2.1 細菌學檢查

挑取血清瓊脂平板上的典型菌落，進行革蘭氏染色、鏡檢，可見大量革蘭氏陽性、短鏈狀或散在的球菌。細菌分離培養結果表明，在鮮血瓊脂培養基上生長良好，菌落呈圓形、表面光滑、中央隆起、邊緣整齊、透明、灰白色的、針尖大的露珠狀小菌落，并產生明顯的B型溶血，即菌落周圍形成完全透明的溶血環。在普通瓊脂培養基上也有菌落生長，但生長不良。

2.2 生化及生長試驗結果

分離菌株在37℃生長良好，在10℃、45℃不能生長，結果見表1。分離菌株可發酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和菊糖，水楊苷和精氨酸試驗為陽性，其他生化試驗結果為陰性，見表2。此株鏈球菌生化反應結果與《伯杰細菌鑒定手冊》中的相應菌株不完全相符。這可能是環境因素導致菌株發生變異，使某些生化特性發生了變化。

2.3 動物試驗結果

接種病料的5只小鼠24h內全部死亡。剖檢可見其肝、脾、腎腫大，膀胱高度充盈，胸腔積液，心冠脂肪出血，用死鼠的心血及胸腔積液涂片，革蘭氏染色鏡檢，發現有大量單個、成對或呈4～6個左右的短鏈革蘭氏陽性球菌。而對照組的5只小鼠均健活。試驗結果表明，此分離菌株對小鼠有很強的致病性。

2.4 溶血試驗結果

以PA法和CH法兩種方法檢測豬源鏈球菌溶血性，結果均為B型溶血。

2.5 乳膠凝集試驗結果

上述分離菌株經鏈球菌A～G乳膠分型診斷試劑盒鑒定，結果可疑，未能分群。

2.6 玻片凝集試驗結果

分離菌株與豬鏈球菌2型標準陽性血清呈陽性反應，生理鹽水對照為陰性。

2.7 藥敏試驗結果

分離菌株藥敏試驗結果，對頭孢噻呋、阿莫西林、頭孢他啶、氧氟沙星、氨芐青霉素高敏；對阿米卡星、環丙沙星、氯霉素中敏；而對青霉素、恩諾沙星、卡那霉素、諾氟沙星、新霉素、慶大霉素、磺胺嘧啶、強力霉素、紅霉素、鏈霉素具有抗藥性，見表3。

3 小結與討論

(1)國內外關于該病的報道很多，而且血清型復雜，根據莢膜多糖抗原可分為35個血清型。分離菌株通過培養特性、菌體形態、菌落形態、染色特性、生化試驗及血清學鑒定等一系列的系統鑒定，確診該豬場豬群發生的以敗血癥為主要特征的傳染病是由豬鏈球菌2型引起。該菌株對營養要求嚴格，要在血清培養基中才能良好生長，呈B溶血。

(2)雖然目前鑒定豬鏈球菌的方法很多，但或多或少存在著一定的缺陷，只有將幾種方法綜合使用，才能獲得更準確的鑒定結果。本試驗經過生化鑒定和血清學鑒定。還可進一步進行PCR鑒定，PCR是一種快速而特異的檢測豬鏈球菌2型的有效方法。

(3)從藥敏試驗的結果看，此分離菌株對青霉素、鏈霉素等常用的藥物具有抗藥性，這可能與大量抗生素普遍濫用有關。動物中大量存在耐藥菌株，一方面使得原有的抗生素失去作用，導致動物細菌性疾病難以控制；另一方面，動物耐藥菌可直接感染人類，導致難以救治的疾病，或間接將耐藥基因(質粒)傳遞給人類病菌，使現有的抗生素失效，危及人類健康。這就提醒人們在采取藥物治療該病之前。最好進行藥敏試驗，根據藥敏試驗結果用藥，從而有效的治療該病。對感染豬鏈球菌2型并出現臨床癥狀的豬，敏感的藥物、合適的給藥途徑有助于感染豬的康復。對該病的藥物治療一定要掌握盡早用藥，劑量足夠、連續用藥的原則。

(4)由于豬鏈球菌的血清型較多，導致近年來在一些豬場，商品化疫苗免疫效果不佳，用苗后仍然呈現小范圍的流行或較高比例散發，造成較大的經濟損失。所以，應采取綜合性防治措施，搞好環境衛生，保持良好的通風和適宜的溫度、濕度：定期消毒，交替使用消毒藥品，防止耐藥性菌株的產生。實行早期斷奶，加強飼養管理，精心飼養，供給優質、營養豐富飼料及清潔飲水，保證各類營養的平衡供給，提高機體的抵抗力。免疫接種是較好的預防措施，為防止商品化疫苗免疫效果不良，可采用自家滅活疫苗進行免疫，但只是權宜之計，應盡快研制有效的新疫苗。