蔥屬植物改良中組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展

摘要：對蔥屬植物組織培養(yǎng)各個方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，包括器官培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。并評述了這些生物技術(shù)在蔥屬植物遺傳育種和品質(zhì)改良中的應(yīng)用前景。同時對現(xiàn)有工作中存在的不足進(jìn)行了總結(jié)。

關(guān)鍵詞：蔥屬植物；組織培養(yǎng)；再生植株

中圖分類號：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006－6500(2008)04－0010－05

蔥屬植物(Allium)屬百合科，約有500個種，我國有70-80種。其中多種為重要蔬菜，如蔥、洋蔥、蒜、韭和薤等。還有一些野生種亦可食用，如山韭、阿爾泰蔥、沙蔥等。這些野生種具有抗寒、抗熱、抗旱、抗病等特征，有的還有藥用價值，是有用的遺傳資源庫，對于栽培種的改良具有潛在開發(fā)應(yīng)用價值。蔥屬植物的離體培養(yǎng)已有不少報道，且多集中在洋蔥、蒜、蔥和韭等少數(shù)幾種植物上，筆者就此做一總結(jié)。

1 組織和器官培養(yǎng)

大蒜、洋蔥等的莖尖是組織培養(yǎng)的優(yōu)良外植體，剝離一定大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)可以達(dá)到脫毒、快繁的效果。洋蔥的莖盤、鱗莖、花，大蒜的未展開葉、氣生鱗莖、蒜瓣，大蔥的葉片、花蕾，韭菜的葉片、根尖都是組織培養(yǎng)中常用的材料，能夠誘導(dǎo)再生植株產(chǎn)生。

大蒜的病毒病是造成大蒜品質(zhì)降低、種性退化的主要原因。到目前為止，發(fā)現(xiàn)能侵染大蒜的病毒有11種，且均為復(fù)合侵染型，主要包括洋蔥黃矮病毒(OYDV)、韭菜黃條病毒(LYsT)和亞實基隆潛引病毒(sLV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯s病毒(PVS)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯M病毒(PVM)、煙草花葉病毒(TMV)和香石竹潛引病毒(CLV)等。在日本，大蒜主要受大蒜花葉病毒(GMV)和大蒜潛引病毒侵染。而中國主栽大蒜主要受LYSV、sLV和PVY 3種病毒侵染。

最早的大蒜脫毒方法是利用熱處理，但該法不能去掉GMV病毒。20世紀(jì)80年代開始，我國的大量學(xué)者進(jìn)行了這些方面的嘗試和研究，包括利用大蒜鱗莖幼芽及下部帶莖盤組織接種，帶一個或不帶葉原基的大蒜分生組織接種等。試驗多采用MS和B5培養(yǎng)基，使用生長調(diào)節(jié)物質(zhì)2，4-D、BA和NAA等，所得試管苗經(jīng)田間試驗顯示，脫毒大蒜的蒜薹產(chǎn)量比對照增加58％-175％，鱗莖增產(chǎn)23％-114％，增產(chǎn)的原因在于減輕了病毒病的危害，改善了植物的自身營養(yǎng)，葉面積增加，葉綠素含量明顯提高等。然而脫毒植株在實際應(yīng)用中可能再度感染，加之試管繁殖系數(shù)尚低。因而規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)還需進(jìn)一步研究。

洋蔥的莖尖培養(yǎng)也進(jìn)行了較多研究，但研究多采用MS培養(yǎng)基，并附加BA和NAA等生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。然而Phillips和Luytem發(fā)現(xiàn)，毒莠定(picloram)對洋蔥莖尖培養(yǎng)的效果比NAA更好。試驗證明洋蔥、阿爾泰蔥、實亭蔥等莖尖在含毒莠定和6-BA的培養(yǎng)基上還誘導(dǎo)出了體細(xì)胞胚。

根尖是分生組織培養(yǎng)的另一材料來源，并已開始受到重視。較之莖尖，根尖取材要方便的多。Shuto等對韭菜和大蔥0.2～0.3mm的根尖部位進(jìn)行培養(yǎng)，在附加NAA 1.0mg／L的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了愈傷組織，在含6-BA 0.01mg／L的培養(yǎng)基上分化出植株，并形成脫毒種質(zhì)。此外，據(jù)報道用大蒜莖尖產(chǎn)生的小植株的根尖切斷作外植體，在含2，4-D條件下可形成愈傷組織，轉(zhuǎn)入附加毒莠定和2ip的培養(yǎng)基后分化出體細(xì)胞胚和再生植株。

蔥屬植物組織培養(yǎng)所用起始材料種類很多。除了分生組織外，還可從莖盤、幼葉、花器官、鱗片等部位取材。Fridberg曾用附加NAA和KT的MS培養(yǎng)基從洋蔥鱗片直接誘導(dǎo)成芽。大蒜以及大蔥器官誘導(dǎo)的愈傷組織均能成功地分化出植株，后者還可開花結(jié)實。有人用一種韭的籽苗基部誘導(dǎo)出了體細(xì)胞胚和高頻率再生植株。

Ayabe和sumi新近建立了一種生產(chǎn)大蒜脫毒試管苗的新方法——莖盤培養(yǎng)法(stem discdome culture)。該法以未成熟的鱗莖基部的莖盤作外植體，以不加外源激素的Is為培養(yǎng)基，一個莖盤可分化出20-30株苗，一個月內(nèi)即可形成小鱗莖，在土壤中移栽后發(fā)現(xiàn)，此法獲得的植株葉片無病毒感染癥狀。Sata利用附加2，4-D1.0mg／L和KT0.5mg／L的White培養(yǎng)基和大蒜小鱗莖基部直接誘導(dǎo)出了體細(xì)胞胚，其誘導(dǎo)率高達(dá)60％。

蔥屬植物為傘形花序，每個花序有上百朵小花，這些小花和花苞內(nèi)產(chǎn)生的許多氣生鱗莖都是組織培養(yǎng)的良好外植體。而利用洋蔥和韭菜的花序、未成熟花芽、花托㈣以及大蔥、洋蔥和山韭的花蕾、大蒜的花梗等也均可有效地誘導(dǎo)出再生苗。這些方法使用的培養(yǎng)基基本上都是MS，BDS和N5，而且有可能使大蔥的繁殖系數(shù)增加一萬倍以上。

2 胚培養(yǎng)

胚培養(yǎng)(embryo culture)是植物組織培養(yǎng)的一個主要方面，早在20世紀(jì)初就作為一種育種手段獲得了成功。蔥屬植物種質(zhì)資源豐富，通過屬內(nèi)種間遠(yuǎn)緣雜交可向栽培種輸入大量的有利性狀。迄今已經(jīng)獲得了很多的雜交后代，但普遍存在的問題是這些后代的結(jié)籽量少，并且有不同程度的雜種不育現(xiàn)象。Guha和Johri首次報道洋蔥的子房和胚珠在Nitsch培養(yǎng)基上可以長成植株，并發(fā)現(xiàn)色氨酸(24μmol／L)對胚的發(fā)育極為有利。Gonzdez和Ford Lloyd在B5+10％椰汁+20g／L蔗糖+1％瓊脂的培養(yǎng)基上培養(yǎng)遠(yuǎn)源雜交的胚珠，獲得了洋蔥x實亭蔥、洋蔥×A.vavilovii、洋蔥×阿爾泰蔥、大蔥x細(xì)香蔥的雜種。Valk等研究了12個洋蔥品種，2個大蔥品種，1個大蔥×洋蔥雜交種和3個韭蔥品種的合子胚產(chǎn)生的愈傷組織，結(jié)果顯示在含5μM 2，4-D的MS培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出緊密型的胚性愈傷組織，在MS+5.1 μmol／L KT培養(yǎng)基上可高頻誘導(dǎo)再生植株，向培養(yǎng)基中加入ABA既可刺激體細(xì)胞胚發(fā)生，又能增加再生芽數(shù)。Silvertand等從一種韭菜(A.ampeloprasum)成熟合子胚誘導(dǎo)的愈傷組織中獲得了再生植株。Luther和Bohance設(shè)計了一個程序，用兩步法培養(yǎng)洋蔥十多個品種的成熟花或子房，該法先將成熟期花在含2，4-D 2.0mg／L+6-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后，再將花或分離的子房轉(zhuǎn)入含TDZ 2.0mg／L的分化培養(yǎng)基上直接再生出苗。

3 單倍體培養(yǎng)

多數(shù)大蒜栽培種為花粉敗育，只有極少數(shù)的品種和個別野生種具有可育花粉，這可能與其表面的粘液阻礙花粉對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有關(guān)。Suk等在MS、Ls和B5基本培養(yǎng)基上添加生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和谷氨酸，對大蒜栽培種Nagano White、Jaein進(jìn)行了花粉組織培養(yǎng)，結(jié)果表明，在25℃，16h的光照條件下，接種25d后可形成愈傷組織，但未見有胚狀體。大蒜花粉在5℃下處理12h并添加NAA，有利于愈傷組織的形成，IAA和2，4-D則沒有效果。B5培養(yǎng)基出芽數(shù)高于LS培養(yǎng)基，在B5培養(yǎng)基上，較高含量的KT有利于不定芽的形成。把不定芽移植到1／2MS誘根培養(yǎng)基上，14d后產(chǎn)生根，接種28d后，平均每一愈傷組織產(chǎn)生5個小鱗莖。

在蔥屬植物中，已經(jīng)從洋蔥和韭菜的未傳粉子房和胚珠培養(yǎng)中誘導(dǎo)出了單倍體植株。田惠嬌利用韭菜未傳粉子房在MS+ZT 0～2.0mg／L+2－甲基－4氟苯氧乙酸(MCPA)培養(yǎng)基上從胚囊中誘導(dǎo)出了單倍體植株，另外，研究還表明，韭菜的反足細(xì)胞的胚胎發(fā)生頻率高于卵細(xì)胞。Kojim等建立了花序培養(yǎng)一胚珠培養(yǎng)一胚培養(yǎng)的再生韭菜雙單倍體培養(yǎng)體系。Campion等也通過雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)出了洋蔥單倍體，首先在BDS+2，4－D 2.0mg／L+BA 2.0mg／L+蔗糖100g／L培養(yǎng)基上進(jìn)行花、子房或胚珠的預(yù)培養(yǎng)，然后在BDS+NAA 1.0mg／L+BA 2.0mg／L+蔗糖100g／L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚狀體，胚狀體發(fā)生的最高頻率為0.59％，63％的胚可再生植株，再生植株中單倍體占88.3％。

4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

蔥屬植物為單子葉，其原生質(zhì)體培養(yǎng)難度很大，至今有關(guān)蔥屬植物原生質(zhì)體再生體系建立的報道很少。陳柔如用洋蔥葉肉進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，觀察到了細(xì)胞團(tuán)。王光遠(yuǎn)等首次將洋蔥葉肉原生質(zhì)體在附加2，4-D和6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得了愈傷組織，轉(zhuǎn)移到含IAA和KT的培養(yǎng)基上獲得了小植株的分化。Buiteveld等用韭菜(A.ampeloprasum)的胚性愈傷組織建立的胚性懸浮細(xì)胞系分離原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得了可持續(xù)分裂和植株再生。隨后，懸浮細(xì)胞系分離原生質(zhì)體技術(shù)在洋蔥上也得到了應(yīng)用。這些研究結(jié)果顯示，蔥屬植物原生質(zhì)體再生體系的建立可能應(yīng)以培養(yǎng)細(xì)胞，特別是培養(yǎng)的胚性細(xì)胞來分離原生質(zhì)體為宜，這與小麥等禾谷類植物原生質(zhì)體培養(yǎng)再生體系的建立十分相似。

5 蔥屬植物組織培養(yǎng)存在的問題及展望

5.1提高胚狀體誘導(dǎo)頻率

單子葉植物誘導(dǎo)胚狀體比較困難，蔥屬植物的離體再生植株大多是通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽或直接誘導(dǎo)不定芽或腋芽的方式進(jìn)行的。與其它植物相比，蔥屬植物在組培中體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率較低，如何高頻誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生是今后工作中需解決的問題。

5.2快繁過程中體細(xì)胞變異的控制

愈傷組織培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生遺傳性變異，特別是染色體倍性的變化，這些變異受外界條件影響較大，又有許多微小變異不容易觀察到，因此較難控制。據(jù)Novak報道，從大蒜愈傷組織上誘導(dǎo)的再生植株中約50％有染色體畸變，如非整倍體、聯(lián)合體。Nandi等培養(yǎng)洋蔥愈傷組織時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)期越長，染色體變異率越高，加入適量的2 ip和NAA則能抑制變異的發(fā)生。Nagakubo等認(rèn)為大蒜的莖尖培養(yǎng)和芽增殖培養(yǎng)中雖然也有不定芽增生，但遺傳變異率很低，少于1％。Phillips等認(rèn)為毒莠定是取代NAA和2，4-D的生長素源，不易引發(fā)變異。培養(yǎng)過程中控制激素的濃度能有效地減少變異。適當(dāng)縮短愈傷組織的培養(yǎng)時間或利用再生植株馴化栽培后循環(huán)培養(yǎng)的方法可減少培養(yǎng)過程中由于激素累積引起的變異。

5.3培養(yǎng)材料再生能力的保持

張松等認(rèn)為大蔥葉片愈傷組織可保持分生能力250d，花蕾愈傷組織可維持一年。Novakl認(rèn)為韭蔥的花培養(yǎng)再生力也可維持一年。隨著組培時間的延長，愈傷組織逐漸老化，變異增多，芽恢復(fù)頂端優(yōu)勢，抑制進(jìn)一步增殖。用大田栽培再生植株，循環(huán)培養(yǎng)即可控制、選擇淘汰變異，又能不斷更新材料的再分化能力，當(dāng)然也可用低溫(4℃)、黑暗保存的方法保存組織培養(yǎng)材料。

總之，蔥屬植物是一大類蔬菜作物，又有藥用價值。目前，通過組織和器官培養(yǎng)技術(shù)，僅在少數(shù)幾種蔥屬植物上建立起了離體再生體系。盡管如此，大蒜的莖尖培養(yǎng)脫病毒和快繁可望在生產(chǎn)實踐中進(jìn)一步應(yīng)用。與此同時，從品質(zhì)改良和遺傳操作的需要考慮，建立更多、更實用的蔥屬其它品種的離體培養(yǎng)再生體系是十分必要的。有關(guān)蔥屬植物的細(xì)胞遺傳操作報道較少，因為這一領(lǐng)域的研究難度很大。近幾年雖然已有新的突破性進(jìn)展，如原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交和外源基因的轉(zhuǎn)化，但蔥屬植物的遺傳操作研究較之其它農(nóng)作物仍顯得非常薄弱，將現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用到蔥屬植物的遺傳改良和育種程序中，定會加速培育出高品質(zhì)、高抗逆性、更有應(yīng)用價值的新品種，以滿足人們生活水平不斷提高的要求。