二苯乙烯苷對Ａβ２５－３５致ＮＧ１０８－１５損傷的保護作用

【摘要】 目的 觀察二苯乙烯苷對Aβ25-35誘導損傷的NG108-15細胞生長、分化的影響。方法 以Aβ25-35誘導NG108-15細胞建立癡呆細胞模型后加入二苯乙烯苷培養，觀察NG108-15細胞的生長狀態、存活率、突起率及突起平均長度。結果 與細胞模型組相比，二苯乙烯苷組能在一定程度上抑制Aβ25-35對癡呆細胞的損傷作用，細胞生長狀態良好，細胞存活率、突起率及突起平均長度與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。結論 二苯乙烯苷對Aβ25-35誘導的NG108-15細胞損傷具有保護作用。

【關鍵詞】 二苯乙烯苷；老年性癡呆；β淀粉樣蛋白；NG108-15細胞

文章編號：1003-1383(2008)05-0517-03中圖分類號：R 749.109.651文獻標識碼：A

Protective effect of stilbene glucoside（TSG） on in NG108-15 

cellular injury induced by Aβ25-35

HUANG Zhongshi，NONG Song，XIE Haiyuan，ZHANG Shuqiu，LI Tao，LI Shubo

(Department of Biochemistry，Youjiang Medical College for Nationalities，Baise，Guangxi 533000，China)

【Abstract】 Objective To observe the effects of TSG on the growth and differentiation of NG108-15 cells which were injured by Aβ25-35.

Methods NG108-15 cells were cultured by Aβ25-35 to establish cell model of Alzheimer's disease (AD) and then were cultured with TSG. The growth state，survival rate，neurite outgrowth and average length of outgrowth of NG108-15 cells were observed.Results TSG could protect NG108-15 cells from Aβ25-35 damage. Compared with model group，the morphology， survival rate， neurite outgrowth and average length of outgrowth of NG108-15 cells were significant difference from TSG group (P＜0.05 or P＜0.01).Con

clusion TSG can protect the NG108-15 cellular injury induced by Aβ25-35.

【Key words】 2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside (TSG); Alzheimer's disease (AD);β-Amyloid protein;NG108-15 cells

二苯乙烯苷（2，3，5，4’-四羥基-二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷，TSG）是何首烏中的主要水溶性成分。近年來發現二苯乙烯苷對神經具有保護作用，其作用機制可能通過鈣通道拮抗、抗氧化、膽堿脂酶抑制劑、調節細胞凋亡等途徑而起作用的，因此對老年性癡呆（Alzheimer’s disease，AD）等神經退行性病變的防治具有很好的應用價值，可開發研制為治療老年性癡呆的新藥物［1～3］。本實驗以Aβ25-35誘導NG108-15細胞建立癡呆細胞模型，并觀察二苯乙烯苷對該模型的影響，現報道如下。

材料和方法

1.實驗材料 ①實驗細胞株：NG108-15細胞由廣西中醫學院鐘振國教授惠贈。②試劑與儀器：主要試劑有二苯乙烯苷（由本教研室根據有關文獻［4］提?。?；Aβ25-35片段，cAMP，Penicillin G，硫酸鏈霉素，MTT（以上試劑由Sigma公司提供）；HAT（次黃嘌呤/胸腺嘧啶核苷/氨甲喋呤）（Gibco 公司提供）；胎牛血清（FBS），DMEM培養基（Hyclone公司提供）。主要儀器為CO2培養箱（Thermo Forma公司）；倒置顯微鏡（南京江南光電股份有限公司）；酶標儀（Metertech公司）。

2.培養方法 將細胞培養分為三組，①正常對照組：以5%FBS培養，不加Aβ25-35；②模型組：以5%FBS培養，加Aβ25-35；③TSG組：以5%FBS培養，加TSG（25、50、100 μmol/L）+Aβ25-35。

細胞增殖培養時，將NG108-15細胞加入細胞增殖液（5%FBS+DMEM+1%HAT+1%雙抗）懸浮細胞，離心，去上清液，分裝至50 ml培養瓶，10%CO2、37℃培養。待細胞基本長滿后，用細胞增殖液將細胞數稀釋至約3萬/ml，傳到96孔培養板，每孔150 μl。繼續培養1天后，去掉原培養液，更新增殖液，同時模型組、TSG組每孔加入Aβ25-35至終濃度為5μΜ，繼續培養48小時。將上述在50ml培養瓶中長滿的NG108-15細胞用細胞分化液（5%FBS+1%HAT+1%雙抗+1 mMcAMP+DMEM）稀釋至約3萬/ml，按每孔150 μl傳到96孔培養板培養。分化液培養，同時模型組、TSG組每孔加入Aβ25-35至終濃度為5 μΜ，繼續培養48小時。

3.觀察指標 ①細胞形態學觀察：每天用倒置顯微鏡對96孔培養板上各組細胞進行觀察及拍照。

②增殖或分化細胞存活率的檢測：用MTT法對增殖或分化培養48小時后的細胞進行檢測，可分別得到與以上兩類細胞存活率相對應的OD值。吸棄待測細胞培養孔內培養液，加無血清DMEM液100 μl/孔，MTT液20 μl，于37℃、10%CO2條件下4小時，出現蘭色結晶后，加SDS-DMF100 μl/孔，于37℃、10%CO2條件下過夜，用酶標儀于λ=570 nm測OD值。

③分化細胞突起率及其平均長度：置分化培養48小時后的分化細胞于倒置顯微鏡下，在培養板每孔上下左右中5個視野各拍片一張，然后在照片上測量軸突的長度和計算突起細胞的百分比，當細胞突起長度超過細胞的直徑時為突起陽性細胞。

4.統計學方法

所有檢測結果以均數±標準差（-±s）表示，采用SPSS11.0統計軟件分析，組間均數比較采用t檢驗，顯著性水平設在α=0.05。

結果

1.細胞形態學觀察結果

以含cAMP分化劑的培養液培養的細胞為分化相，不含cAMP的為增殖相。增殖相細胞的形態觀察結果顯示：對照組、TSG組細胞增長良好，胞漿均勻透亮，周圍呈絨毛狀及有短突起，細胞表面無明顯斑點及沉積物；模型組細胞數量明顯減少，胞漿較暗淡，有斑點、空泡，部分細胞變黑、聚集及死亡。分化相細胞的形態觀察結果顯示，各組細胞有較長的細胞突起，TSG組突起較模型組長，胞漿均勻透亮，模型組部分細胞有斑點，變黑或死亡。（見圖1~6）。

2.各組增殖細胞存活率的比較 不加Aβ25-35的正常對照組增殖最快，OD值最高；模型組增殖最慢，OD值最低。各組與正常對照組比較均有顯著性差異（P＜0.01）；TSG各劑量組與模型組比較具有高度顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

3.各組分化細胞存活率的比較 在分化劑cAMP的作用下，NG108-15細胞將停止增殖而成為分化細胞，不含Aβ25-35的正常對照組與原代播下的細胞數基本相同，可設其存活率為100%，實驗結果顯示含Aβ25-35的各組細胞數均低于正常對照組。經組間t檢驗，TSG組的OD值與正常對照組比較具有高度顯著性差異（P＜0.01），與模型組比較亦具有高度顯著性差異(P＜0.01)。TSG各劑量組均能提高NG108-15分化細胞的存活率。見表2。

4.各組分化細胞的細胞突起率及突起平均長度比較

在分化劑cAMP的作用下，NG108-15細胞將分化成為具有較長突起的分化細胞。各組細胞突起率中以不加Aβ25-35的正常對照組最高。經組間t檢驗，TSG低、中劑量組的細胞突起率與正常對照組比較具有高度顯著性差異（P＜0.01），TSG各組與模型組比較具有高度顯著性差異(P＜0.01)。各組細胞突起平均長度比較，模型組明顯短于其它組(P＜0.01)，TSG組與模型組比較，差異具有高度顯著性(P＜0.01)。見表3。

討論

AD是一種原發性大腦神經退行性病變，為特有的中樞膽堿能神經元的大量死亡及丟失，伴有老年斑（SP）、神經纖維纏結（NFT）的形成、膽堿能神經細胞的損害、膽堿乙?；D移酶（ChAT）水平下降和乙酰膽堿（Ach）遞質合成的降低、突觸蛋白I（Synapsin Ⅰ）水平下降、乙酰膽堿遞質釋放減少等特征［5～7］。NG108-15細胞株為神經腫瘤細胞，由小鼠的神經胚胎母細胞瘤（Neuroblastoma，不能合成Ach）與大白鼠神經膠質細胞瘤（Glioma，能合成Ach，但不能釋放）細胞雜交融合而成。這種雜交細胞能無限地繼代繁殖，能合成并釋放乙酰膽堿遞質，具有神經細胞的突起以及正常神經細胞所具有的離子通道及酶等［8～10］。因此，具有膽堿能特性的NG108-15細胞作為神經細胞模型，能較好地模擬AD的病理改變。Aβ是AD病患者大腦組織中老年斑的主要成分，它的活性部位在第25到35個的11個氨基酸片段。在NG108-15細胞加入Aβ25-35片段，可使細胞的形態學、死亡率、ChAT活性水平、SynapsinⅠ水平、Ach遞質釋放能力等與AD病理生理變化基本一致，因此，可用Aβ25-35片段誘導NG108-15神經細胞建立AD細胞模型［11～12］。

本實驗結果顯示：經5 μM Aβ25-35作用48小時后，NG108-15細胞形態結構及生長分化情況較正常培養的細胞發生了明顯的變化。無論是增殖相還是分化相，細胞數量都明顯減少，可見死亡、變黑、碎裂細胞；分化細胞的突起率降低，細胞突起平均長度也明顯減少，表明Aβ25-35片段可損傷體外培養的NG108-15細胞，抑制細胞的生長和分化，并進一步誘導細胞死亡，而二苯乙烯苷組細胞增長良好，細胞透亮、均勻，表面無明顯斑點及沉積物，細胞存活率、細胞突起率及細胞突起平均長度與模型組比較，均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），表明二苯乙烯苷能在一定程度上抑制Aβ25-35對細胞的損傷作用。有關其詳細的保護作用機制，仍需通過進一步實驗加以證實。

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(收稿日期：2008-08-13 修回日期：2008-09-11)

(編輯：崔群飛 英文審校：鐘京梓)