新版血站技術(shù)操作規(guī)程離心法制備的冷沉淀凝血因子FⅧ和血漿纖維蛋白原含量分析

黃華霖 劉偉平 馮葉 陳菊芬 彭及良

目前在臨床上，為避免造成血液資源的浪費和減少輸血反應(yīng)，奉行患者“缺什么，輸什么”的原則［1］。因此，血站工作人員將采集到的全血經(jīng)離心、分漿、速凍、融化、病毒滅活等一系列措施制備成各種血液制品（血小板、血漿、冷沉淀等）［1］。冷沉淀屬于血漿衍生物，是新鮮冰凍血漿在低溫條件下融化生成的白色沉淀物［2］。目前常通過采用特定的提取方法制成，即將新鮮冰凍血漿（fresh frozen plasma，F(xiàn)FP）在（4±2）℃封閉狀態(tài)融化后，進(jìn)一步分離出沉淀在血漿中的冷不溶解物質(zhì)，并在1 h 內(nèi)凍結(jié)而制成的成分血［3］。冷沉淀在自采血之日起于-18℃以下可保存1年，37℃水浴融化后即可輸注。冷沉淀凝血因子里主要含有凝血因子Ⅷ（Coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，VwF）、纖維蛋白原（Fibrinogen，F(xiàn)ib）等［4］。臨床上冷沉淀凝血因子主要用于Ⅷ因子、Ⅻ因子、纖維蛋白原缺乏癥和血友病等凝血功能障礙性的疾病，同時，其在治療創(chuàng)傷、燒傷和嚴(yán)重感染還有術(shù)后出血方面，具有良好的療效［5-6］。

新版《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2019 版）規(guī)定，離心法制備冷沉淀凝血因子的容量為40～50 mL，與《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2015 版）的20～30 mL 比較，提高了冷沉淀凝血因子的制備容量［7］。在臨床上，冷沉淀凝血因子特別適用于難以輸注大量FFP 來提供充足的凝血因子的患者，以防止患者發(fā)生循環(huán)超負(fù)荷［8］。冷沉淀凝血因子的容量影響患者的輸注療效。新版血站技術(shù)操作規(guī)程大幅提高了離心法制備冷沉淀凝血因子的容量，因此，值得探討容量改變是否會對FⅧ和Fib 含量產(chǎn)生影響，但目前相關(guān)研究較少。因此，本研究采用改良離心法（壓沉法）與常規(guī)離心法（常規(guī)漂浮法）制備冷沉淀凝血因子，比較通過不同方法制備的冷沉淀凝血因子的FⅧ含量、Fib 含量和合格率。報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 樣本來源

隨機抽取40（人）份于2020年11月至2020年12月在深圳市龍崗區(qū)中心血站無償獻(xiàn)血者符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》的全血（400 mL/份），并將采集的血樣采用CPDA-1 抗凝，儲存于4℃環(huán)境，將其均分裝成為200 mL 全血，并于采血后17～18 h分離制備成原料血漿（Raw Plasma，RP）100 mL/袋。隨后進(jìn)行標(biāo)記區(qū)分：壓沉法（對照組）和常規(guī)漂浮法（實驗組），于-50℃血漿速凍機速凍成FFP，低于-20℃環(huán)境儲存。

1.1.2 獻(xiàn)血者資料

40 名無償獻(xiàn)血者年齡介于20～58 歲，平均年齡（37.80±8.92）歲，其中男性37 名、女性3 名；18 名受試者為初次獻(xiàn)血，其余22 名受試者獻(xiàn)血次數(shù)均超過2 次。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑

全自動凝血分析儀（STAGO-STA Compact）配套檢測試劑盒：FⅧ（希森美康有限公司，批號：256488）；Fib（希森美康有限公司，批號：255701）、纖維蛋白原檢測試劑盒（希森美康有限公司，批號547031）。

1.2.2 儀器

4℃血液儲存箱（日本SANYO 公司）；大容量低溫離心機（德國Thermo 公司）；全自動血液成分分離機（德國LMB 公司）；多美達(dá)血漿速凍機（盧森堡Dometic 公司）；水浴式低溫融化箱（美國Polyscience 公司）；醫(yī)用低溫箱（日本SANYO 公司）；電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；全自動凝血分析儀（法國STAGO 公司）。

1.3 方法

1.3.1 冷沉淀凝血因子制備

對照組：根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2015 版）［9］，將對照組40 袋制備的FFP 放入改良水浴式低溫融化箱融化，至基本融化時，取出于2～6℃以離心半徑31.6 cm、轉(zhuǎn)速3 800 r/min 離心10 min，將每袋的冷上清轉(zhuǎn)移至1 個新的100 mL 空袋中，袋底剩余的20～30 mL 血漿與冷不溶解物質(zhì)混合即為冷沉淀凝血因子，并在1 h 內(nèi)置于-50℃血漿速凍機速凍。

實驗組：根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2019版）［10］，將對照組40 袋FFP 置于4±2℃水浴式低溫融化箱中，至基本融化時，取出于2～6℃以離心半徑31.6 cm、轉(zhuǎn)速3 800 r/min 離心10 min，將每袋的冷上清轉(zhuǎn)移至1 個新的100 mL 空袋中，袋底剩余的40～50 mL 血漿與冷不溶解物質(zhì)混合即為冷沉淀凝血因子，并在1 h 內(nèi)置于-50℃血漿速凍機速凍。

兩組制備好的冷沉淀凝血因子均儲存于-20℃冰箱待用。

1.3.2 FⅧ與Fib 含量測定

取同一無償獻(xiàn)血者以兩組方法制備的冷沉淀凝血因子，同一時間置于電熱恒溫水槽中完全融化后充分混勻，各留取8 mL/份的標(biāo)本并立即用全自動凝血分析儀進(jìn)行FⅧ和Fib 含量測定。

1.4 冷沉淀凝血因子質(zhì)量（合格）標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《全血及成分血質(zhì)量要求》GB18469-2012［11］，100 mL/袋的FFP 制備得到的冷沉淀凝血因子，F(xiàn)Ⅷ≥40 IU/袋、Fib≥75 mg/袋。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量數(shù)據(jù)以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)數(shù)據(jù)以n（%表示，用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法制備的凝血因子中FⅧ和Fib 含量比較

實驗組制備的凝血因子容量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組與實驗組的FⅧ含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實驗組Fib 含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組凝血因子中FⅧ與Fib 含量比較（±s）Table 1 Comparison of Fⅷand Fib contents in coagulation factors of the two groups（±s）

表1 兩組凝血因子中FⅧ與Fib 含量比較（±s）Table 1 Comparison of Fⅷand Fib contents in coagulation factors of the two groups（±s）

組別對照組實驗組t 值P 值n 40 40容量（mL）28.91±0.41 46.53±1.21 85.640 0.000 FⅧ含量（IU/100 mL）70.55±21.16 67.00±20.09 2.923 0.066 Fib 含量（mg/100 mL）118.03±24.18 144.96±25.77 14.435 0.000

2.2 兩種方法制備的冷沉淀凝血因合格率比較

兩組的冷沉淀凝血因子FⅧ與Fib 合格率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組冷沉淀凝血因子合格率比較［n（%）］Table 2 Comparison of qualified rate of cryoprecipitate coagulation factor between the two groups［n（%）］

3 討論

離心法制備冷沉淀首先要做的就是把原料新鮮冰凍血漿放在水浴箱中融化，調(diào)控水溫使之維持在2～6℃，待血漿基本融化后，及時取出，離心［12］。因為冷沉淀對溫度的要求比較高，所以離心機在離心前需要進(jìn)行預(yù)溫處理，保證產(chǎn)品的質(zhì)量。離心后取出在低溫料理臺上用血液分漿夾把上層的大部分血漿分離出來，下層少量血漿和不易溶解的白色沉淀物即為冷沉淀。分離完成后在1 h內(nèi)將冷沉淀速凍呈固態(tài)并置于-20℃以下的低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，有效期從采血之日起為一年?3-14］。冷沉淀中含有凝血因子Ⅷ、血管性假血友病因子、纖維蛋白原、纖維結(jié)合蛋白，因子ⅩⅢ等，適用于兒童及成人輕型甲型血友病、血管性血友病、先天性或獲得性纖維蛋白原缺乏癥及因子XⅢ缺乏癥病人，也用于手術(shù)后出血、嚴(yán)重外傷及早期彌漫性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）等病人的替代治療［15］。目前采供血機構(gòu)比較常用的冷沉淀凝血因子制備方法是虹吸法和離心法。離心法在4℃條件下重度離心，將解凍后的FFP 中的不溶物質(zhì)沉淀到血袋底部，提高了冷沉淀凝血因子的制備回收率。FⅧ是冷沉淀凝血因子有效成分中不穩(wěn)定的凝血因子，其含量的高低反映了制備方法的優(yōu)劣。離心法制備冷沉淀凝血因子的關(guān)鍵因素包括FFP 融化時的溫度和時間、冷沉淀凝血因子的容量等［16］。本站冷沉淀凝血因子制備采用離心法壓沉法水浴方式融化FFP 制備冷沉淀凝血因子，該方法通過加1 個不銹鋼網(wǎng)蓋到水浴式低溫融化箱，解決了其融化血漿時可能出現(xiàn)的部分血袋漂浮在水面上的問題，使FFP 融化溫度精準(zhǔn)控制在4±2℃，縮短融化時間，該方法制備的冷沉淀凝血因子容量明顯高于常規(guī)離心法。但對照組與實驗組的FⅧ含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示不同離心方法制得的冷沉淀凝血因子容量對FⅧ含量無影響。

此外，對照組的Fib 含量低于實驗組，有統(tǒng)計學(xué)意義。歐洲輸血委員會最新標(biāo)準(zhǔn)［17］指出，冷沉淀凝血因子的容量為30～40 mL，最大容量為40 mL；去冷沉淀冰凍血漿與FFP 比較，F(xiàn)ib 含量有所下降。而且相關(guān)文獻(xiàn)研究顯示，去冷沉淀冰凍血漿中Fib含量約為FFP 的31.8%（0.88 g/L：2.77 g/L）［18］。在冷沉淀凝血因子制備過程中，F(xiàn)ib 未能完全與FⅧ結(jié)合成冷不溶解物質(zhì)，F(xiàn)ib 游離在冷上清中，當(dāng)剩余容量減少時，F(xiàn)ib 相應(yīng)減少。但兩組的Fib 合格率一致，均為92.5%，符合國標(biāo)要求［19］（75%的抽檢結(jié)果落在質(zhì)量控制指標(biāo)范圍內(nèi)，可認(rèn)為血液采集和制備過程受控）。Fib 是冷沉淀凝血因子有效成分中穩(wěn)定的凝血因子，在Fib 不足的情況下，可以聯(lián)合使用Fib 的純化濃縮物，達(dá)到減少輸血量的目的。

FFP 是不超過18 h 將血漿從全血中分離出并在1 h 內(nèi)凍結(jié)而制成的成分血。本研究制備冷沉淀凝血因子所用的40 袋FFP，從全血采集到成分分離后速凍成FFP 時間控制在17～18 h，達(dá)到FFP 的最低質(zhì)量要求。本研究通過比較改良離心法（壓沉法）與常規(guī)離心法（常規(guī)漂浮法）制備冷沉淀凝血因子，探討《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2019 版）離心法制備冷沉淀凝血因子的FⅧ含量、Fib 含量和合格率。最終制備的冷沉淀FⅧ與Fib 合格率均符合要求，且Fib 含量高于《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2015 版），值得將新版血站技術(shù)操作規(guī)程推廣應(yīng)用。

綜上，本研究采用兩種不同的方式制備冷沉淀凝血因子從而探討《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2019 版）離心法制備冷沉淀凝血因子容量改變的可行性。結(jié)果，根據(jù)新版《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2019 版）制備的冷沉淀FⅧ與Fib 合格率均符合要求，且Fib 含量較高，建議采用新版血站技術(shù)操作規(guī)程制備冷沉淀。