五種國產與進口小鼠病毒ELISA抗體檢測試劑盒的比較研究

王 吉，衛 禮，付 瑞，李曉波，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，國家實驗動物質量檢測中心，北京 100050)

國家標準規定，實驗小鼠病毒抗體檢測方法主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫酶試驗(IEA)、免疫熒光試驗(IFA)、血凝試驗(HA)、血凝抑制試驗(HAI)、免疫組織化學試驗(IH)。但實驗室通常采取ELISA法作為主要檢測手段。作為國家實驗動物質量檢測中心，在承擔來自全國各省市送檢實驗動物質量檢測任務的同時，還為實驗動物相關單位提供實驗動物病毒ELISA抗體檢測試劑盒。為提高ELISA法檢測的準確性及可靠性，保證ELISA抗體檢測試劑盒的質量，我們制備的淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、仙臺病毒(SV)、腺病毒(MAV)、小鼠細小病毒(MPV)等5種病毒ELISA抗體檢測試劑盒與美國Charles River公司生產的試劑盒進行比較，客觀評價和分析了國產試劑與進口試劑的真實性及可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

國產小鼠淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、肝炎病毒(MHV)、仙臺病毒(SV)、腺病毒(MAV)、細小(MPV)病毒 ELISA抗體檢測試劑盒(批 號 分 別 為 090122、090129、090206、090207、090212):本室生產;進口淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、仙臺病毒(SV)、腺病毒(MAV)、小鼠細小病毒(MPV)ELISA抗體檢測試劑盒(批號分別為:LCM:His3(102808)T、MHV:17(070908)T、SV:Q(012808)P、MadV:F-10(11280F)Q、MPV:302(072808)U):美國 Charles River產品;小鼠血清:2010年國內送檢的24份陰性血清和12份陽性血清。

1.2 主要儀器

酶標儀:Thermo Multiskan MK3;37℃水浴箱:上海森信實驗儀器有限公司 DK-4500B型;37℃培養箱:WGP-600。

1.3 方法

1.3.1 實驗操作及判斷標準的確定:

1.3.1.1 實驗操作依據各自試劑盒說明書進行。

1.3.1.2 判斷標準

(1)國產試劑盒:在陰、陽對照成立的情況下:待檢血清特異抗原孔A值≥0.2;待檢血清特異抗原孔A值/陰性對照特異抗原孔A值≥2.1;特異抗原孔和正常抗原孔A值比值≥2.0時，判為陽性［1］。

(2)進口試劑盒:在陰陽對照成立的情況下(陰性對照特異抗原孔＜0.13，陽性對照特異抗原孔＞0.26):特異抗原孔和正常抗原對照孔A值均＜0.13，判為陰性;特異抗原孔和正常抗原對照孔A值均 ＞0.26，判為陽性;特異抗原孔 A值 ＞0.26，正常抗原對照孔A值 ＜0.26，用特異抗原孔A值減去正常抗原對照孔A值的差≥0.39時，判為陽性。

1.3.2 敏感性試驗:兩種試劑盒分別檢測國產、進口陽性血清。血清從1:40依次倍比稀釋到1:81920，進行檢測。按照2種試劑盒的判斷標準，最大稀釋比例的陽性孔為其檢測靈敏度［1，2］。

1.3.3 特異性試驗:用5種試劑盒分別檢測國內和國外其他4種陽性血清，同時設陰、陽對照。觀察每種試劑盒與其他4種病毒有無交叉反應［2］。

1.3.4 精密性試驗:同一批次試劑盒，測同一份陽性血清，同一稀釋度同時做20孔，計算檢測結果的批內變異系數［1］。

1.3.5 穩定性試驗:將同一批次抗原包被板于4℃放置30、90、180 d，同時檢測已知4份陰性和4份陽性血清，計算試劑盒檢測數值結果的變化率(相對偏差)，比較試劑盒的時間穩定性［1，2］。

1.3.6 可信度:分別用國產和進口 LCMV、MHV、SV、MAV、MPV抗體 ELISA檢測試劑盒，檢測已經用商品化 LCMV、MHV、SV、MAV、MPV IFA 抗體檢測試劑盒檢測過的各自相對應的已知24份陰性血清和12份陽血清，驗證國產和進口ELISA試劑盒的可信度［1－4］。

1.3.7 統計方法:對實驗數據用SPSS11.5統計軟件進行卡方(χ2)檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，均具有統計學意義［5，6］。

2 結果

2.1 敏感性試驗

(1)國產和進口試劑盒檢測國產陽性血清

表1 敏感性實驗檢測結果1Tab．1 Results of detection sensitivity obtained with the domestic and imported ELISA kits．I．

從表1檢測結果看，國產和進口的MHV和SV試劑盒檢測靈敏度均很高，國產試劑盒是進口試劑盒的2倍，差異顯著(，P＜0.05);LCMV和 MPV檢測靈敏度國產試劑盒均是進口試劑盒的的8倍，差異極顯著(P＜0.01);MAV檢測靈敏度進口試劑盒是國產試劑盒的16倍，差異極顯著(P＜0.01)。

(2)國產和進口試劑盒同時檢測進口強陽性血清

表2 敏感性實驗檢測結果2Tab．2 Results of detection sensitivity obtained with the domestic and imported ELISA kits．II．

從表2檢測結果看，LCM、MPV試劑盒檢測靈敏度相同，均為1:80;國產和進口 MHV和 SV試劑盒檢測靈敏度均較高，進口試劑盒是國產試劑盒的2倍，差異顯著(P＜0.05);進口 MAV試劑盒檢測靈敏度是國產的16倍，差異極顯著(P＜0.01)。

2.2 特異性試驗

每種試劑盒分別檢測國內、國外其他5種病毒陽性血清，在陰、陽性對照均成立的情況下，對其他4種病毒陽性血清檢測，結果均為陰性，說明每種試劑盒與其他4種病毒均無交叉反應。

2.3 精密性試驗

國內外五種試劑盒精密性試驗結果(批內平均變異系數%)見表3。

表3 精密性試驗結果(批內變異系數%)Tab．3 Results of detection precision obtained with the domestic and imported ELISA kits(coefficient variations%)

國內外5種試劑盒精密性試驗檢測結果顯示均小于10%。

2.4 穩定性試驗

穩定性試驗檢測結果見表4。

表4 穩定性試驗結果(相對偏差%)Tab．4 Results of detection stability obtained with the domestic and imported ELISA kits(Relative deviation，%)

穩定性試驗結果顯示五種國產試劑盒和進口試劑盒，測得的相對應的8份血清的 A值變化率(相對偏差)均小于25%。

2.5 可信度

每種病毒抗體的24份陰性血清，使用國產和進口試劑盒檢測符合率均為100%，LCMV、MHV、SV、MPV 4種病毒抗體的12份陽性血清，使用國產和進口試劑盒檢測符合率均為100%，僅有國產MAV試劑盒檢測已知12份陽性血清，檢測符合率為86.1%(表 5)。

表5 ELISA方法檢測已知LCMV抗體陰、陽血清結果Tab．5 Detection results of known negative and positive sera samples with the domestic and imported ELISA kits

3 討論

敏感性試驗顯示，LCMV和MPV國產試劑盒檢測國產和進口陽性對照血清靈敏度分別為1∶640和1∶80，進口試劑盒檢測國產和進口陽性對照血清靈敏度均為1:80，說明 LCMV、MPV國產試劑盒檢測敏感性不比進口試劑盒低。MHV、SV國產與進口試劑盒檢測國內陽性血清顯示靈敏度均很高(均達到1:2560以上)，且國產試劑盒高于進口試劑盒2倍;國產與進口試劑盒檢測進口陽性血清顯示靈敏度均較高(均達到1:320以上)，且進口試劑盒高于國產試劑盒2倍，說明國產MHV、SV試劑盒檢測敏感性與進口MHV、SV試劑盒檢測敏感性均較好，同時也說明了國產和進口試劑盒抗體檢測水平相當［4，7］。

國產MAV試劑盒檢測國產和進口試劑盒陽性血清，靈敏度均很低，分別為 1∶80和 1∶40，且檢測國產陽性對照血清 A值最高只有0.461，檢測進口陽性對照血清，A值最高只有0.304。而用進口試劑盒檢測國產和進口試劑盒的陽性對照血清靈敏度均達到1:1280，且檢測的 A值均很高，進口試劑盒檢測國內MAV陽性對照血清A值最高達到1.153，進口試劑盒檢測進口陽性對照血清最高達到0.972。這說明我們的試劑盒抗原包被板抗原性很低，導致抗原抗體結合反應能力降低，使試劑盒檢測敏感性下降，即抗體檢測水平下降［4，7］。同時通過此次試劑盒比對實驗也使我們找到了近2年來檢測過程中發現MAV陽性對照血清A值下降的原因。國產試劑盒用的檢測抗原是經過蔗糖梯度純化的全病毒抗原，而病毒是用細胞來進行傳代培養，也就是我們在傳代培養MAV過程中，可能是由于細胞毒性導致了培養細胞病變，誤認為是病毒導致細胞病變，而且一代一代傳下去，而導致病毒抗原性下降。本實驗室通過分子生物學檢測也證實了這一點。用PCR方法對本室傳代的MAV進行檢測時，檢測結果為陰性，而用同一PCR方法檢測從美國ATCC新購的MAV(編號VR-550)傳代培養的P3代細胞毒，檢測結果為陽性。

但MAV試劑盒的陽性對照血清抗體效價很高，可能與檢測用抗原(批號:080624)和免疫用抗原(批號:030322)不是同一批號有關，且通過此實驗證明國產MAV試劑盒陽性對照血清抗體效價還很高，說明當時用于制備抗血清用的免疫用抗原(批號:080624)的抗原性還沒有下降，而用于檢測用包被抗原(批號:080624)抗原性已經下降。

在試劑盒顯色劑使用方面，進口試劑盒使用ABTS(2，2'-連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，國產試劑盒使用 OPD作為 ELISA顯色劑，雖然敏感、特異，但由于OPD(鄰苯二胺)具有揮發和致突變效應，所以國內試劑盒顯色劑需要進行改進。

通過此次比對實驗不但使我們找到了國產MAV試劑檢測盒敏感性下降的原因，也提示我們，實驗室原有的病毒傳代培養方式，可能有的病毒不能適應，所以為了保證和提高檢測試劑的質量，有些病毒的傳代培養方式需要更新或改變。同時也說明除 MAV試劑盒外，與進口試劑盒比，國產LCM、MHV、SV、MPV試劑盒在敏感性、特異性、精密性、穩定性及可信度方面均較好，而且通過在2010和2011年“實驗動物質量檢測機構比對實驗”中，用國產小鼠肝炎(MHV)、小鼠仙臺(SV)ELISA抗體檢測試劑盒的進行不同人員及不同實驗室的比對實驗，也證明了國產小鼠肝炎(MHV)、小鼠仙臺(SV)ELISA抗體檢測試劑盒的質量可靠，穩定性、重復性、準確性均較好。

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