反相高效液相色譜法測定血漿中帕羅西汀濃度

摘 要 目的：建立高效液相色譜法測定血漿中帕羅西汀濃度的方法。方法：采用島津LC-VP型高效液相色譜儀，YWG-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射波長為350 nm；流動相為乙腈和pH3.2的25 mM的磷酸鹽緩沖液（35∶65，v/v）；流速為1 mL/min。采用內(nèi)標(biāo)法。結(jié)果：帕羅西汀的血漿線性范圍是2.5～100 ng/mL，r=0.998 9，平均回收率為91.37%，穩(wěn)定性RSD均小于8%。結(jié)論：本方法靈敏度高，分離效果佳，方便實用。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 帕羅西汀 血藥濃度

中圖分類號：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1006-1533(2007)09-0417-02

帕羅西汀是目前市場上廣泛應(yīng)用的一種5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRI），是目前抗抑郁治療的主要藥物。帕羅西汀的療效和不良反應(yīng)與其血藥濃度有明顯相關(guān)性，并且血藥濃度個體差異非常大，常規(guī)劑量下，血藥濃度范圍可從10 ng/mL波動至30 ng/mL，這就需要對藥物進(jìn)行治療藥物濃度測定，以保證個體能達(dá)到有效的血藥濃度，保證療效。帕羅西汀血藥濃度測定有多種方法，如HPLC-MS、HPLC-FL、HPLC-UV［1～3］，但這些方法往往步驟繁瑣或成本較高，不適合常規(guī)應(yīng)用。本文介紹一種操作簡便、成本低廉、適用于常規(guī)應(yīng)用的反相高效液相色譜法來測定血漿中帕羅西汀的濃度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-VP型高效液相色譜儀，包括LC-10ATVP輸液泵、RF-10AXL熒光檢測器、CLASS-VP色譜工作站、DGU-12A在線脫氣機；80-2臺式離心機（上海手術(shù)器械廠）。

1.2 試藥

帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)品（浙江尖峰藥業(yè)有限公司提供，批號：20070111）；氟西汀標(biāo)準(zhǔn)品（常州四藥制藥有限公司提供，批號：20061210）（內(nèi)標(biāo)物）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：反相YWG-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射波長為350 nm；流動相為乙腈和pH3.2的25 mM的磷酸鹽緩沖液（35∶65，v/v）；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為50 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)品置于容量瓶中，用甲醇溶解，配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩＞芊Q取內(nèi)標(biāo)物氟西汀標(biāo)準(zhǔn)品置于容量瓶中，用甲醇溶解，配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩＊?/p>

2.3 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品1 mL，加0.2 mL的0.1 MNaOH，加入50 μL的內(nèi)標(biāo)物，搖勻，加乙醚3 mL，旋渦振蕩3 min，以3 000轉(zhuǎn)/min的速度離心10 min，靜置10 min，分離有機層。重復(fù)萃取1次，合并上層液，于37 ℃水浴中氮氣流吹干，殘余物用200 μL流動相溶解，取50 μL進(jìn)樣。帕羅西汀保留時間約為10.35 min，內(nèi)標(biāo)氟西汀保留時間約為12.11 min。兩者分離完好，無血漿內(nèi)源物干擾。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測限

取1 mL空白血漿7份，加50 μL的內(nèi)標(biāo)物，定量（50 μL）加入帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，使其濃度分別為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 ng/mL。按血漿樣品處理項進(jìn)行操作，測定帕羅西汀和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，以濃度對峰面積比值進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y＝24.918+18.876X，r=0.998 9，本方法的最低檢測限是1.0 ng/mL（最低檢測濃度為儀器信號噪音的3倍）。

2.5 提取回收率

取1 mL空白血漿3份，加50 μL的內(nèi)標(biāo)物，定量（50 μL）加入帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻，使其濃度分別為2.5、50、100 ng/mL，按血漿樣品處理項進(jìn)行操作，得到峰面積比值。取標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動相稀釋成上述3個濃度，加50 μL的內(nèi)標(biāo)物，混合均勻后，不經(jīng)提取，直接取50 μL進(jìn)行進(jìn)樣，得到峰面積比值。兩個峰面積比即為提取回收率。結(jié)果見表1。

2.6 精密度

取空白血漿溶液按照提取回收率項下配制低、中、高這3種濃度(2.5，10，100 ng/mL)，按血漿樣品處理項操作，在1 d內(nèi)分別重復(fù)進(jìn)樣5次，得3種濃度的日內(nèi)重復(fù)性。在5 d內(nèi)分別每天重復(fù)進(jìn)樣，得3種濃度的日間重復(fù)性。結(jié)果見表2。

2.7 穩(wěn)定性

取空白血漿，按照回收率項下配制低、中、高這3種濃度(2.5，50，100 ng/mL)。放置于室溫，分別于1 h、2 h、4 h、6 h和8 h進(jìn)行處理，進(jìn)樣，測定，評價室溫下的穩(wěn)定性。同樣，配制上述3種濃度的血樣，配制后放入-20 ℃進(jìn)行冷凍保存。分別于第1天、第7天、第14天取出進(jìn)行血樣處理、進(jìn)樣測定，評價其冷凍狀態(tài)的穩(wěn)定性。同時考察血漿樣品在冷凍-融化循環(huán)3次實驗，評價樣品在凍融狀態(tài)的穩(wěn)定性。上述測定結(jié)果均顯示，帕羅西汀的濃度無明顯降低（ＲＳＤ<8%），提示血漿樣品穩(wěn)定性完全滿足日常工作條件。

3 討論

本文所述的簡便實用的樣品處理方法，通過兩步萃取，提高了樣品的回收率，并且比固相萃取和柱切換法便捷，并可降低成本，特別適用于常規(guī)帕羅西汀的血藥濃度監(jiān)測。

本研究結(jié)果證明，本方法分離度佳、靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好、專屬性高，是測定帕羅西汀的有效方法。

參考文獻(xiàn)

1 Jae-Gook Skin， Kyung-Ah Kim， Young-Ran Yoon， et al. Rapid simple higy-performance liquid chromatographic determination of paroxetine in human plasma［J］. Journal of Chromatography：Biomedical Sciences and Applications， 1998.713 (2)：452-456.

2 C. Lopez-Calull， N. Dominguez. Determination of paroxetine in plasma by higy-performance liquid chromatographic for bioequivalence studies［J］. Journal of Chromatography:Biomedical Sciences and Applications，1999，724(2)393-398.

3 林治光、李華芳、翁毅仁，等，帕羅西汀片在健康志愿者體內(nèi)的生物等效性［J］.中國臨床藥學(xué)雜志，2005，14(4): 231-233.

(收稿日期：2007-07-15)