活血降糖膠囊對Ｔ２ＤＭ大鼠主動脈粥樣硬化血管壁核因子－ｋＢ表達的影響

摘要：目的 觀察活血降糖膠膠囊對2型糖尿病(T2DM)大鼠并發主動脈粥樣硬化血管壁核因子-Kb(NF-kB)表達水平的調控作用。方法 選1月齡SD大鼠45只，隨機取8只為空白組(灌服等量蒸餾水)，其余為實驗組，成模大鼠隨機分為中藥組[灌服活血降糖膠囊懸浮液1.44g/(kg·d)和模型組(灌服等量蒸餾水)。每天灌胃1次，連續治療30d后，取主動脈做常規石蠟切片，免疫組化觀察其核因子-kB(NF-kB)表達的程度。結果 模型組主動脈內膜出現典型粥樣硬化病變，活血降糖膠囊中藥組動脈膜受損程度有所減輕。模型組主動脈血管壁NF-kB表達明顯增加，活血降糖膠囊中藥組均可降低其主動脈NF-kB表達(P＜0.05)。結論活血降糖膠囊可降低動脈粥樣硬化大鼠主動脈壁NF-kB表達的作用，發揮對抗血管壁的炎性損傷作用。

關鍵詞：活血降糖膠囊；核因子kB；動脈粥樣硬化

中圖分類號：Rj43.1 R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)12-1208-02

糖尿病引起動脈粥樣硬化(atherosderosis，AS)的機制是多方面的，單高血糖而言，形成不可逆的糖化蛋白、糖化脂蛋白、糖基化終產物(AGE)等大分子物質與血管內皮細胞上的相應受體結合，增加炎癥因子的表達，增加氧化損害的程度，引起血管組織結構和功能的損害，而促使AS形成。隨著炎癥細胞和炎癥介質的不斷檢出，AS不再被認為是單純動脈壁脂質堆積的疾病，而是進展性炎癥反應。在AS的啟動、病變之進展及晚期并發癥中炎癥始終起中心作用。研究表明炎癥反應過程涉及了機體多種基因，而這些基因的啟動子和增強子存在一個或多個kB序列，其活化前提是核因子kB(nuclearfactorkappaB，NF-kB)的激活。在形成AS的復雜網絡結構中，NF-kB的活化是一個中心環節，可與相關基因啟動子或增強子特殊KB序列相結合，調控基因的表達，在免疫應答、炎癥反應及細胞生長與凋亡等方面發揮重要作用。通過制作實驗性2型糖尿病(T2DM)大鼠AS模型，利用免疫組織化學方法觀察活血降糖膠囊對AS大鼠主動脈NF-kB表達及血管壁形態的影響，進一步探討活血降糖膠囊的抗AS作用機制。

1 材料與方法

1．1 藥物與試劑 活血降糖膠囊(主要為血竭、丹參、太子參等組成)，由廣州醫學院第一附屬醫院藥劑科提供，批號：Z030222531；STZ和枸櫞酸均購自廣州威佳科技有限公司；血糖儀及其試紙購自OneToucH^TM強生(中國)醫療器材有限公司；NF-xBD65濃縮型多克隆抗體(效價1:100)購自武漢博士德生物工程公司；二步法Supervision試劑盒及DAB顯色試劑購自上海長島生物工程有限公司。

1．2 動物與飼料 SPF級1月齡雄性SD大鼠45只，體重140g～160g，購自廣州中醫藥大學動物實驗中心。動物合格證號：SCXK(粵)2003-0001。SPF級基礎飼料由廣州中醫藥大學動物室提供。高脂高糖飼料由基礎飼料加入煉豬油15％、白糖20％、雞蛋5％、膽固醇1％、食鹽0.1％。

1．3 實驗動物模型建立及給藥方法 參考黃霖等造模方法，均自由飲水，適應性喂養3d后隨機抽取8只作為空白組，喂以基礎飼料；其余的喂高脂、高糖飼料共6周并注射2％鏈脲佐菌素(STZ)30mg/kg，然后將大鼠隨機分為中藥組[灌服活血降糖膠囊1.44g，(k8·d)]、空白組和模型組(以相當劑量蒸餾水灌服)。每天灌胃1次，連續30d后，取主動脈常規石蠟切片做HE染色，Weiger彈力纖維染色；免疫組化法觀察NF-kBp65的表達程度。

1．4 光鏡、電鏡標本的制備 取主動脈血管長約1cm，生理鹽水沖洗，予10％的中性甲醛溶液中固定2h～4h，逐級酒精脫水，石蠟包埋，常規切片，HE染色，Weigert彈力纖維染色以乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下攝片。

1．5 NF-kBp65的免疫組化結果判定 免疫組織化學染色均采用兩步法，具體操作步驟按說明書進行。用O1ympus顯微鏡觀察，陽性表現為胞核、細胞質黃染，無黃染者為陰性細胞。計算機圖像分析儀測定陽性產物的光密度，每張切片選取5個高倍視野計算平均值。每組切片選取5葉視野，共計數陽性細胞占400個細胞百分比。

1．6 統計學處理 計量資料以均數±標準差(x±s)表示，由SPSS 11.5軟件對配對資料進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 活血降糖膠囊對大鼠AS病變影響的光鏡觀察

2．1．1 HE染色 空白組：主動脈形態正常，內皮細胞連接緊密，無脂質條紋或纖維斑塊，內膜完整，無炎性細胞浸潤，內彈力膜完整，無斷裂。模型組：主動脈內膜斷裂，泡沫細胞增多，散在炎細胞浸潤，中層平滑肌增生且排列紊亂，脂質沉積，斑塊形成，部分模型血管腔可見血栓形成。中藥組：內皮細胞脫落可見有部分修復，脂質沉積，范圍局限，散在少量泡沫細胞。

2．1．2 Weigert彈力纖維染色 空白組內彈力膜完整，無增生；模型組內膜顯示有多量增生纖維，多數內彈力板分離、斷裂，甚至消失；中藥組內膜增生不明顯，彈力板斷裂較模型組有所減少，部分拉伸變平。

2．2 NF-kB陽性表達 空白組血管壁見少量NF-kB陽性表達細胞，胞質內有少量不均勻的黃褐色顆粒狀物；模型組血管胞核中表達NF-kB的細胞比例顯著高于空白組(P ＜0，01)，而中藥組血管壁中胞核陽性的細胞比例顯著低于模型組(P＜0，05)。各組NF-kB表達陽性率。詳見表1。

3 討 論

病理解剖顯示，糖尿病病人無論在冠狀動脈還是腦動脈、腎動脈、周圍動脈都存在較同齡非糖尿病病人更為嚴重的AS。同時糖尿病病人因動脈粥樣硬化性疾病引起的死亡占糖尿病總病死率的80％，較普通人群多。自Brand等首次采用p65mAb標記技術證實在AS的形成過程中存在著NF-kB因子參與，多個研究證實在斑塊損害處的血管平滑肌細胞(VSMC)、內皮細胞、巨噬細胞中存在著NF-kB因子的廣泛活化，而在無損害的血管處卻極少發現。已證實NF-kB激活后可誘導參與調控與AS有關的基因包括：炎癥細胞因子(MCP)、急性蛋白、轉錄因子、免疫受體、生長因子(PDGF)、趨化因子、細胞黏附分子及誘導型一氧化氮合酶等多種物質等。這些因子對細胞的活化、趨化、浸潤和增殖起調控作用。當NF-kB刺激血管內皮細胞過度表達這些炎癥因子，可進一步促進VSMC的遷移和增殖，促進AS的發展。也有實驗證實NF-kB的抑制劑IKKB-A，IKK-2nd可部分抑制白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)。從影響NF-kB出發深入探討其干預AS的作用及其機制，有可能成為AS中醫藥治療及其機制研究的新的切入點。

活血降糖膠囊以血蝎、三七、丹參活血化瘀；太子參補氣，石斛養陰潤燥；枸杞滋補肝腎，消補兩調，標本兼治。已有研究表明，活血化瘀藥如丹參、血竭、三七具有降血脂、改善血液黏稠度、促進血液循環、減少及延緩并發癥發生的作用；補氣藥太子參能提高血中胰島素含量，促進胰島釋放胰島素，以降低血糖；石斛、枸杞等養陰藥具有良好的降糖、降脂作用。通過祛邪、扶正發揮減少高血糖，血脂紊亂對內皮的直接損傷，從而達到治療AS的目的。本實驗發現：中藥組內皮細胞脫落、脂質沉積、泡沫細胞、炎細胞浸潤、平滑肌增生、排列紊亂及彈力板斷裂數量和范圍均較模型組減少，血管胞核中NF-kBp65表達胞核陽性的細胞比例顯著低于模型組(P＜0.05)，推測活血降糖膠囊對AS血管的保護作用可能通過其非降脂效應即抑制，AS血管NF-kB的表達而發揮抗AS，為臨床防治AS的產生提供新的理論依據。

作者簡介：黃霖(1952—)，女，畢業于廣州醫學院，主任醫師，碩士研究生導師，現工作于廣州醫學院第一附屬醫院(郵編：510120)；李迎新，現為廣州醫學院2005級碩士研究生；劉華、陸冬曉、羅崇謙，工作于廣州醫學院第一附屬院。

(本文編輯 郭懷印)