２株抗枯萎病尖鐮孢菌內(nèi)生細菌菌株的分離及鑒定

摘 要：華南地區(qū)因尖鐮孢菌引起的枯萎病發(fā)生較為嚴重，特別是近年來發(fā)現(xiàn)的香蕉枯萎病，對香蕉產(chǎn)業(yè)來說更是毀滅性的病害。分離、篩選有拮抗活性的內(nèi)生細菌是防治枯萎病的有效措施之一。從海南紅樹林健康葉片中分離到102株非致病性內(nèi)生細菌菌株，通過室內(nèi)抗菌活性的測定，得到了2株對枯萎病尖鐮孢菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株。通過對它進行形態(tài)、生理生化特性及16SrDNA序列等方面的研究，確定其中1株為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，命名為BS－009：另一株確定為新發(fā)表種Bacillus Mojavensis的一個相似種，命名為BM－027。

關鍵詞：內(nèi)生細菌；鑒定；芽孢桿菌；16SrDNA

中圖分類號：S182 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2007)04-483-04

拮抗內(nèi)生菌是存在于健康植株中有抗菌活性的菌株，是農(nóng)業(yè)生物防治中潛在的資源菌。近年來，國內(nèi)相繼對多種植物，特別是經(jīng)濟作物上的拮抗內(nèi)生菌開展了相關研究。但專門針對紅樹林拮抗內(nèi)生菌的報道較少。紅樹林是一種稀有的木本胎生植物，其生育環(huán)境比較特別，主要生長在南北回歸線之間的陸地與海洋交界帶的灘涂淺灘，是陸地向海洋過度的特殊生態(tài)系，而內(nèi)生菌則是該微生態(tài)系中重要的成員之一。我國華南地區(qū)因尖鐮孢菌引起的枯萎病發(fā)生較為嚴重，特別是近年來發(fā)現(xiàn)的香蕉枯萎病，對香蕉產(chǎn)業(yè)來說更是毀滅性的病害，因此，分離、篩選有拮抗活性的內(nèi)生細菌對防治枯萎病具有非常重要的意義。本實驗從海南采集到的紅樹林樣品中分離內(nèi)生細菌，并對其中抗枯萎病尖鐮孢菌的菌株進行了篩選與鑒定，期望篩選到具有商業(yè)應用價值的拮抗菌株。

1 材料和方法

1．1 病原指示菌

香蕉枯萎病菌F1 (F.oxysporunt f．sp．cubenseFace 1)、香蕉枯萎病菌F4 (F. oxysporum f．sp．cubense race 4)、黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp． cucumerinum)、番茄枯萎病菌(F. oxysporum f.sp．ly－copersici)。以上指示菌均來源于本實驗室。

1．2 內(nèi)生細菌分離

從海南采集超過20枚紅樹林葉片樣品，帶回實驗室經(jīng)表面消毒，破碎后直接涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3～5 d。挑取不同類型的單個菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上連續(xù)純化，直至得到純培養(yǎng)物。接牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面，28℃培養(yǎng)4 d后存于4℃冰箱中備用。

1．3 拮抗活性的測定

用接種環(huán)取1環(huán)液體培養(yǎng)48 h的菌液．在含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中間劃一直線，于直線2側2 am處分別放1塊直徑為5 mm的病原菌絲塊，以單獨放菌塊為對照。每處理重復3次，在28℃下培養(yǎng)7 d后檢查抑菌帶的有無。

1．4 內(nèi)生細菌的形態(tài)特征和生理生化特性

測試項目包括分離菌的菌落和菌體形態(tài)特征、鞭毛和芽胞的有無和著生情況、革蘭氏染色以及生理生化反應。參照東秀珠等編著的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行初步分類。

1．5 16S rDNA的PCR擴增和序列分析

總DNA的提取按張桂山等和林萬明的方法。PCR擴增使用以下引物：Primer：(與16SrDNA5’端8－27位點堿基相同)5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；Primer B：(與16SrDNA 3’端1 52～1 504位點堿基互補)5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

PCR反應體系(50 μL)為：10×PCR緩沖液(含Mg²⁺)5 μL，dNTP(5 mmol／L)0.5 μL，引物BSF8／27和引物BSRl523／20各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，Taq酶2.5 μL，超純水18.5 μL。PCR程序為：94℃5 min：94℃45 s，50℃45 s，72℃1 min，循環(huán)29次：72 ℃延伸5 min。PCR測序由鼎國生物技術有限責任公司完成。

1．6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株BS-009、BM-027的16S rDNA序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast相似性分析，隨后用DNAStar6.0軟件進行系統(tǒng)學分析，生成系統(tǒng)進化樹，用Clustal V算法進行聚類分析。

2 結果與分析

2．1 內(nèi)生細菌拮抗活性的測定結果

對超過20枚紅樹林葉片樣品中分離得到的100多株內(nèi)生細菌進行室內(nèi)抗菌活性測定(表1)。結果發(fā)現(xiàn)有2株菌株對香蕉枯萎病菌1號生理小種、香蕉枯萎病菌4號生理小種、黃瓜枯萎病菌等有明顯的拮抗作用。

2．2 2株拮抗內(nèi)生細菌的形態(tài)特征和生理生化特性

菌體形態(tài)特征：經(jīng)革蘭氏染色、油鏡檢查和電鏡觀察，結果為：BS-009菌體為桿狀，營養(yǎng)體大小為3.0 μL×0.8 μL，芽孢大小為1.7 μL×0.7 μL，周生鞭毛，芽孢位于菌體中間，橢圓形，周生鞭毛，革蘭氏陽性；BM-027菌體桿狀，芽孢中生，芽孢不使孢囊膨大，大小為3.0 μL×0.7 μL，芽孢大小為1.5 μL×0.5μL，周生鞭毛，革蘭氏陽性(圖1～2)。

菌落形態(tài)特征：內(nèi)生菌BS-009菌落培養(yǎng)時為隆起狀，邊緣呈波浪形，直徑為0.3 cm，不透明，顏色為淡黃，不產(chǎn)色素。內(nèi)生菌BM-027菌落培養(yǎng)時為臍狀，邊緣呈波浪形，直徑為0.5 cm，不透明，顏色為淡紅，產(chǎn)黃紅色色素。

生理生化測定：內(nèi)生菌BS-009，最適生長溫度為28～30℃，50℃以上不能生長，質(zhì)量分數(shù)5％NaCl條件下能生長。能水解明膠、淀粉，VP試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，卵磷酸試驗陰性，苯丙氨酸脫氫酶試驗陰性，不分解酪氨酸，能利用檸檬酸鈉、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖；內(nèi)生菌BM-027，最適生長溫度為28～30 ℃，53 ℃以上不能生長，質(zhì)量分數(shù)5％Natl條件下能生長。能水解明膠、淀粉，VP試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，卵磷酸試驗陰性．苯丙氨酸脫氫酶試驗陰性．不分解酪氨酸，能利用檸檬酸鈉、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖。

2．3 BS-009與BM-027的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步確定菌株的分類學地位，測定其16SrDNA基因序列，擴增目的基因序列長度分別為1 262、1164 hp。將菌株BS-009(GenBank號為EF064785)與BM-027(GenBank號為DQ980622)的16SrDNA基因序列在GenBank中進行Blast相似性分析，發(fā)現(xiàn)BS-009、BM-027與芽胞桿菌(Bacilluss)的16SrDNA基因序列相似，用DNAStar6．0軟件對BS-009與BM-027進行系統(tǒng)學分析，同時用ClustalV算法聚類結果見圖3、4所示。可看出，菌株BS-009與枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)聚成一群，序列相似性最高達到99.3％：菌株BM-027與Bacillusmojavensis單獨聚為一群，2者的序列相似性達到95.7％。綜合生理生化和16SrDNA基因序列的分析結果．鑒定菌株BS-009為枯草芽胞桿菌(BaciUussubtilis)、菌株BM-027為Bacillus mojavensis。

3 討論

內(nèi)生細菌與從土壤分離篩選的拮抗菌明顯不同之處就在于它是從健康的植株體內(nèi)分離得到的，不受外界環(huán)境的影響，能較大程度地發(fā)揮其生物學作用，因而成為生物防治的潛在生物資源，具有廣闊的研究和應用價值。從辣椒、馬鈴薯、棉花等作物體內(nèi)分離篩選到的內(nèi)生細菌多具有防病、促生及生物固氮等廣泛生物學作用，并已證明它能在植物體內(nèi)定殖傳導，長期發(fā)揮作用，可用于生物肥料和生物殺菌劑的研制開發(fā)。

何紅等對辣椒不同部位進行內(nèi)生菌的分離及相關研究，比較得知從辣椒葉片中分離的內(nèi)生細菌最多，并且，通過抗利福平突變菌株接種實驗測定內(nèi)生細菌BS-1和BS-2定殖的宿主范圍及定殖時間。此外，他們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌對宿主有促生和傳導作用。夏正俊等研究發(fā)現(xiàn)菌株的拮抗性與它在植物體內(nèi)移動具有一定相關性，在體內(nèi)無明顯移動的細菌菌株具較弱或不具有誘導抗性。本研究得到的拮抗內(nèi)生菌BS-009和BM-027是從紅樹林葉片樣品中篩選得到的，尚未對紅樹林其他部位進行分離。2菌株雖對鐮刀菌的不同致病型具有明顯的抑制作用，但在植株體內(nèi)的定殖傳導、定殖的接種方式、定殖范圍、作用機制、大田試驗等方面還有待于研究。以便進一步確認篩選得到的菌株是否具有應用前景。

從16SrDNA基因序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，菌株BS-009、BM-027在分類地位上都有準確的定位，這與其相應的形態(tài)特征、生理生化特征相符，因此，綜合16SrDNA基因序列及相應的形態(tài)特征生理生化特征來鑒定微生物是一種非常準確的方法。通過聚類分析，BS-009與Bacillus subtilis的16SrDNA存在99.5％的同源性，因此確定BS-009為枯草芽孢桿菌。而Bacillus mojavensis在分類上屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)專性寄生于植物體內(nèi)一個亞群，此亞群還包括Bacillus amy．10liquefaciens、B．a(chǎn)trophaeus、B．1icheniformis、Bre-vibacterium halotolerans、Paenibacillus lentimorbusand P. popilliae等6個其他子亞群。該芽孢桿菌亞群與Bacillus subtilis在分類區(qū)別上唯一的差異在于脂肪體氨基酸序列的細微不同。根據(jù)表型特征及系統(tǒng)發(fā)育分析，將BM-027歸屬于Bacillus moiavensis中一個子亞群，但該菌株尚不能定種，還需要與模式種進行DNA雜交，根據(jù)同源性作進一步分析。

4 結論

實驗篩選得到的2株內(nèi)生細菌BS-009和BM-027經(jīng)室內(nèi)測定對鐮刀菌的不同致病型具有明顯的抑制作用。在相應的形態(tài)特征生理生化特征研究基礎上，綜合16SrDNA基因序列鑒定拮抗內(nèi)生菌BS-009和BM-027是較為準確的方法。通過分析，鑒定菌株BS-009為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、菌株BM-027歸屬于Bacillus mojavensis中一個子亞群。