新高及愛宕梨雄性不育特性及其敗育的細胞學研究

摘 要：為研究梨雄性不育表現和細胞學特征，觀察分析了新高、愛宕和豐水(對照)梨花器官特征、花粉數量和育性，比較了花藥和小孢子發育過程的細胞學特征。結果表明，新高、愛宕花藥較小，花藥內花粉粒數量很少、且活力低，表現出雄性不育的空囊花藥。新高小孢子敗育主要發生在單核晚期，但在小孢子母細胞減數分裂期就表現出部分異常；愛宕小孢子敗育也主要發生在單核晚期，而此前發育正常。認為新高、愛宕小孢子敗育可能與絨氈層提前解體有關。

關鍵詞：梨；小孢子；雄性不育；細胞學

中圖分類號：S661．2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2007)04-433-05

新高(Niitaka)(天之川×今村秋)和愛宕(Atago)(二十世紀×今村秋1梨為日本梨品種，上個世紀由日本引入中國，2者具有雄性不育特性。梨是典型的配子體型自交不親和性果樹，生產中必須配置授粉品種或人工輔助授粉，才能獲得應有產量和品質。因此，了解梨品種的花粉數量、育性具有重要意義。目前新高和愛宕花粉敗育的時期和機制尚未見報道。我們以薪高、愛宕為試材，以可育品種豐水(Housui)為對照，探討新高、愛宕花粉敗育的過程和途徑，為分析和利用不育材料提供試驗依據。

1 材料和方法

樣品采自南京農業大學江浦園藝站梨資源圃內，供試品種新高、愛宕和豐水梨。自2005年2月下旬花芽萌動前開始取樣至4月初開花期為止。定期采集花芽，1周2次，剝除鱗片后，用FAA固定液固定，常溫保存。石蠟切片，厚度6～8 μm，鐵礬－蘇木精染色，固綠復染，中性樹膠封固，光學顯微鏡觀察并拍照。

初花期(2005年4月－8日)采集新高梨、愛宕梨及對照豐水梨即將開放的大花蕾或初開花各100朵觀察花器官特征，并用游標卡尺測量花器官長度，隨機測量20朵花，取平均值；剝出花藥，一部分用于花粉量測定，一部分散粉后用于花粉萌發率的測定，具體方法參照張紹鈴等的方法。數據結果應用SPSS數據分析軟件分析差異顯著性。

2 結果與分析

2．1 新高、愛宕梨雄性不育性的表現

將新高、愛宕及對照豐水梨大花蕾進行花器比較觀察(表1)，除花藥外，新高、愛宕梨花器官形態正常，愛宕花朵較小，花器官也最小，新高花朵較大，花器官(包括花絲長)也最大。愛宕花藥小，顏色淺，用手指輕捻無可見花粉。新高花藥較大，但比豐水花藥小，尤其花藥橫徑較短，不飽滿，輕捻亦無可見花粉。豐水花藥最大，飽滿，用手指輕捻有大量花粉。

不同品種的成熟花藥的花粉粒數差異很大，新高和愛宕梨單花藥的花粉量分別為462粒和183粒，分別為對照豐水梨(6689粒)的6.9％和2.7％，表明新高、愛宕梨花藥花粉量很少，遠低于豐水梨；每朵花的花藥數也因品種不同而異：主要因為單花藥花粉量不同，新高、愛宕花朵花粉量與豐水梨有極大差異，分別只有豐水梨的7.2％和2.3％，這表明新高、愛宕花朵花粉量很少(表2)。

雄性不育品種新高、愛宕梨的花粉萌發率也極低，分別只有4.4％和2.4％，而且萌發的花粉管長度很短，只有雄性可育品種豐水梨(花粉萌發率84.8％)的3.2％(表2)。表明新高、愛宕梨不僅花粉數量稀少，而且僅有的花粉發育不良，無生活力或生活力很低。

2．2 豐水花藥和小孢子發育過程

梨樹越冬前，雄蕊原基已經形成并開始分化。早春氣溫回升，花藥繼續分化。在2月下旬至3月上旬，即花前1個月，花藥壁分化完全，從外向內依次為藥室內壁、中層(2層)、絨氈層，呈同心圓排列，圓心處為小孢子母細胞(圖版-1)。絨氈層細胞較大、多核，細胞質均勻緊密，染色較深(圖版-1)。花前20 d，小孢子母細胞即花粉母細胞分離，減數分裂開始(圖版-2)。此時絨氈層細胞具退化跡象，細胞形狀開始不規則，排列也開始疏松；中層細胞貯藏物質減少，細胞變為扁平狀，以后逐步解體被吸收(圖版-2)。隨后小孢子母細胞完成減數分裂形成大小均勻的四分體(圖版-3)?；ㄇ?5 d，四分體解體，單核小孢子游離出來。剛游離的小孢子較小，形狀不規則，核較大、細胞質較濃；藥室內壁正在發育，絨氈層內含物減少，中層已變成一薄層(圖版-4)。小孢子逐漸發育，體積增大、變圓?；ㄇ?0 d，小孢子繼續發育，體積迅速增大，細胞核從中央移至細胞的一側，小孢子壁已發育的非常明顯(圖版-5)?；ㄇ?～7 d，單核晚期的小孢子的細胞核進行有絲分裂，生成2個子核，形成大小不等的2個細胞：生殖細胞和營養細胞。雙核花粉粒積累營養物質，染色較深，此時，絨氈層顯著解體，核消失，內含物消失殆盡(圖版-6)。4月初，梨樹初花。豐水梨花粉粒發育成熟，絨氈層和中層消失，僅余部分殘跡；兩相鄰藥室相通，裂腔開裂，準備散粉(圖版-7)。

2．3 新高、愛宕花藥發育和小孢子敗育過程

新高花藥發育比豐水早2～3 d，開花也早一些。新高花藥發育前期發育正常，形成正常的小孢子母細胞，藥壁組織也正常(圖版-8)。在減數分裂期，新高部分花藥部分藥室的小孢子母細胞異常，絨氈層也發生解體(圖版-9)。但大部分花藥大部分藥室小孢子母細胞能夠正常進行減數分裂，形成正常的四分體。新高四分體可以正常分離，并可以正常發育至單核晚期(圖版-11)，也有部分藥室小孢子剛分離，絨氈層即明顯退化(圖版-10)。單核晚期，絨氈層細胞細胞核消失，組織崩潰；大部分小孢子此時停止發育，內含物消失，多數小孢子還保留完整的細胞核(圖版-12)。雙核花粉期，小孢子繼續解體，絨氈層和中層基本消失，僅留部分殘跡，藥室開始收縮，藥室內壁仍能發生正常的帶狀纖維質加厚(圖版-13)。花粉成熟期，新高花藥藥室已空(圖版-14)，僅殘留部分降解產物及少數殘余花粉粒。藥室內壁能夠正常加厚，花藥也能正常開裂(圖版-14)。

愛宕花藥發育早期比較正常，一直到單核細胞分離，都是正常的(圖版-15)。單核晚期，絨氈層細胞細胞核大部分消失，組織開始解體；小孢子也停止發育、空泡化(圖版-16)。隨后小孢子發生解體，絨氈層解體消失，僅留部分殘跡(圖版-17)。與新高類似，大部分小孢子解體后，藥室發生收縮。至花粉成熟期，花藥表現與新高類似：藥室內壁可以正常加厚，花藥也能正常開裂(圖版-18)。

3 討論

新高、愛宕梨花器官形態正常，雄蕊形狀正常，花藥較瘦小．花藥內有少量花粉，大多數花粉無生活力，極少數花粉還有較弱的生活力，敗育并不完全。韓愛華等總結雄性不育品種新梨7號的形態特征為：花器小，花瓣均較小；雄蕊花絲短、且細，花藥瘦小、干癟，無花粉?；蛑挥袠O少數花粉粒，表現出雄性不育的空囊花藥，但雌蕊發育正常。愛宕的花器官形態特征與新梨7號相似，而新高的花朵較大，除花藥外，花器官形態大小均正常。

新高、愛宕花藥發育至花蕾即將開放時，花粉囊中的花粉大部分消失，花粉囊收縮，這與新梨7號的花粉成熟期表現相似，也類似于崗山白桃等的空花粉囊現象。新高、愛宕單核晚期絨氈層迅速解體，而可育花藥的絨氈層在雙核期才會發生全面衰退。絨氈層是藥壁的最內一層，它包圍著花粉母細胞或小孢子，在花粉形成和發育中起著重要作用：轉運營養物質，保證小孢子發生發育的需要；合成胼胝質酶，分解包圍四分體的胼胝質壁；提供構成花粉外壁的孢粉素；產生外壁蛋白等。此外，絨氈層還控制藥室內壁的加厚。在花粉發育過程中，絨氈層細胞自然降解消亡。絨氈層細胞的適時解體，可以及時提供花粉發育所需的營養物質，并為花粉粒體積激增提供空間。絨氈層的降解可能是由于絨氈層細胞的程序性死亡(programmed cell death)或細胞凋亡(apopto－sis)引起的。絨氈層發育和降解的異常，往往會影響小孢子的正常發育。大多數研究認為，花粉敗育是因為絨氈層異常，即絨氈層細胞在花粉形成和發育過程中過度肥大液泡化、提前或延遲退化。羅來水等研究發現，花藥空囊是桃雄性不育的主要表現形式之一，并分析絨氈層異常是導致花藥空囊產生的主要原因。何天明等研究了新梨7號小孢子敗育過程，認為新梨7號小孢子敗育主要發生在單核小孢子期，單核花粉的解體與囊壁絨氈層的液泡化與增生關系密切：絨氈層的異常分化直接導致單核花粉產生營養障礙而停止正常發育，同時導致纖維層分化不良，囊壁不開裂。新高、愛宕小孢子敗育過程與新梨7號相似，小孢子敗育的原因可能與絨氈層提前解體有關：新高、愛宕絨氈層細胞程序化死亡發生紊亂，絨氈層提前降解，導致大部分小孢子得不到足夠的營養物質，以致小孢子敗育。少數幸存的花粉粒發育不良，生活力低。與新梨7號不同，新高、愛宕的藥室內壁能夠正常發育，藥室也能夠正常開裂。這可能因為新高、愛宕絨氈層解體稍遲，藥室內壁的發育未受影響。

Laser等曾指出植物雄性不育花藥的敗育可以發生在小孢子發育的任何一個時期，單子葉植物多數在單核至雙核期，雙子葉植物多發生在四分體至小孢子形成期。由于不同的不育系控制雄性不育的基因不同，雄性不育系小孢子的敗育時期會兇為基因的表達時期和基因的作用方式的不同而不同。因此，不同植物種類的雄性不育系甚至同一種類的不同雄性不育系敗育的時期和方式都是不同的。凡軍民研究的3個大豆CMS不育系，因質、核不同敗育時期也不相同，其中NJCMS2A小孢子大量敗育發生在單核晚期，在大量敗育之前，自小孢子母細胞期至單核期均有部分敗育發生。本試驗觀察到新高小孢子敗育過程與之類似，愛宕小孢子敗育的主要時期與新高一致，敗育過程則簡單一些。研究表明，植物雄性不育是由基因控制的，本試驗的形態解剖結果是基因表達的結果，因此與愛宕相比，新高控制雄性不育的基因可能更為復雜些，與此相關的基因尚有待于進一步研究。

4 結論

新高、愛宕花器官形態正常，其中雄蕊除花藥外形狀正常，花藥較小不飽滿：新高、愛宕花藥都有少量花粉，少數花粉還有較弱的生活力。新高和愛宕小孢子敗育的主要時期都是單核晚期，只有少數小孢子可以完成發育；新高、愛宕單核晚期絨氈層迅速解體，同時小孢子停止發育、開始敗育，而可育花藥的絨氈層在雙核期才會發生全面衰退；研究認為新高、愛宕小孢子敗育與絨氈層提前解體密切相關。