梨品種資源遺傳差異的ＲＡＰＤ分析

摘 要：明確種質間的遺傳差異，對雜交育種中親本的選擇和搭配具有重要意義。利用隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術，從40個隨機引物中篩選出了33個多態性好的引物，在21個品種間進行了分析，最終得到339個清晰穩定的擴增位點，其中多態性位點為292個，占86.1％。利用UPGMA(非加權配對算術平均)法進行了品種間相似系數的計算以及聚類分析，揭示了這些品種間遺傳上的差異程度。

關鍵詞：梨；品種；RAPD；遺傳差異

中圖分類號：S661．2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2007)04-525-04

梨屬于薔薇科(Rosaceae)、梨亞科(Pomideae)、梨屬(Pyrus L)植物，原產于歐洲、東亞、中亞和地中海附近，有中國、中亞、近東3個起源中心。梨屬植物由于種間雜交容易獲得可育的后代，在長期的馴化栽培中，不僅形成了類型多樣的品種，而且品種問的親緣關系也較為復雜。因此在遺傳上進行分類鑒定和親緣關系的探討不僅對揭示物種的演化有重要意義，而且有利于指導梨的雜交育種工作，如對親本的檢測和對后代分離情況進行預測等。

隨機擴增多態性DNA(RAPD)是基于PCR技術的一種快速簡便的分子標記形式。可以利用該技術獲得物種間DNA水平上的多態性資料，并進行統計分析，了解它們的主要遺傳物質——DNA之間的同源程度，從而確定它們的親緣關系和進化地位。目前，這一技術已廣泛應用于梨種質鑒定、遺傳多樣性檢測等研究。

我們將利用RAPD標記技術，對目前山東省生產上有重要應用價值的21個梨栽培品種進行DNA水平遺傳多樣性的分析，旨在了解其遺傳差異程度，為梨雜交育種親本的選擇和搭配提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料

試材取自萊陽農學院果樹實驗站，共有21個梨品種(表1)。

1．2 基因組DNA提取與檢測

基因組DNA提取參照田義軻等的方法。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的質量，并估算其質量濃度，將最終質量濃度調至25 mg／L左右。

1．3 PCR擴增及產物鑒定

PCR擴增在PTC－200基因擴增儀上進行。在25 μL反應體系中含模板DNA50 ng，10堿基隨機引物0.45 μmol／L，Taq酶1.2 U，dNTPs 0.2 mmol／L，MgCl，2.5 mmol／L。隨機引物和dNTPs購自上海Sangon公司。Taq酶和A-HindⅢMarker購自大連TaKaRa公司。反應混合物用15 μL礦物油覆蓋。擴增程序為：94℃預變性4 min，然后94℃變性35 s，37℃退火35 s，72℃延伸90 s，共40個循環，最后在72℃延伸5 min。擴增產物經1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1xTAE，電壓為4-5 V／cm，于UVP成像系統中觀察照相。

1．4 數據統計與分析

對在樣品間表現多態性好的引物，統計其擴增位點。在電泳圖譜上，同一擴增位點上有電泳帶記為1，無電泳帶記為0，作0／1矩陣。用NTSYS-pc軟件進行分析，相似系數采用Dice系數．最后用UPGMA方法構建聚類圖。

2 結果與分析

2．1 RAPD多態性檢測

通過對40個隨機引物在品種間的RAPD分析，從中篩選了了33個多態性高的引物(表2)，共檢測到339個位點，擴增片段為200-2800 bp。其中多態性位點為292個，位點多態性比率為86.1％。

在這33條多態性引物中，擴增位點最多的引物是S₁₀₄₆，共14個；最少的是S₁₂₇₇，共7個。部分引物的擴增圖譜見圖1。

2．2品種間的遺傳相似性及聚類分析

相似系數的計算表明。黃縣長把梨和幸水的遺傳相似系數最小，為0.458 9，二十世紀和黃金梨的遺傳相似系數最大，為0.801 3。當閾值在0.640 0－0.656 0處可將所有品種分為6類：(1)晚三吉、綠寶石、水晶、豐水、黃金梨、二十世紀、新高；(2)黃縣長把、中香、棲霞大香水、蘋果梨、萊陽香水、小香水、圓黃；(3)新梨七號；(4)雪花梨、鴨梨、茌梨；(5)巴梨；(6)幸水、碭山酥(圖2)。其中，第(1)全為砂梨系統品種，(4)全為白梨系統品種，(2)和(6)既有白梨系統的品種，也有砂梨系統品種。

3 討論

從聚類圖上可以看出，水晶、黃金梨、二十世紀、新高這些梨品種間有較高程度的遺傳相似性。由于黃金梨是由二十世紀與新高雜交產生的，水晶梨是新高梨的芽變，它們之間理應在聚類圖上顯示出較近的親緣關系。中香是以棲霞大香水與茌梨雜交產生的后代，所以中香梨與棲霞大香水表現出極為相近的親緣關系，然而中香梨與茌梨的遺傳相似程度表現較小，可見母本對其遺傳影響程度遠超過了父本。蘋果梨與中香、棲霞大香水、黃縣長把梨親緣關系較近，這一結果也支持了曲柏宏等的蘋果梨屬于白梨系統的分類觀點，但滕元文等認為蘋果梨為獨立于白梨和砂梨系統之外的另一個類群。關于這個問題，還需要進一步的研究探討，以便找到更充分的根據。

本研究顯示，白梨系統中的鴨梨、雪花梨、茌梨歸為一類，但類群內品種間的遺傳差異較大。白梨系統中的碭山酥與砂梨系統的幸水、白梨系統中的萊陽香水與砂梨系統的圓黃品種親緣關系較為相近，而幸水與砂梨系統的其他品種相距較遠，表明白梨系統與砂梨系統之間的一些品種親緣關系較其系統內一些品種為近。黃禮森等曾從梨屬植物的花粉形態方面觀察到這一現象。滕元文等以及曲柏宏等均運用分子標記手段證實過類似的問題。可見，白梨和砂梨系統品種間的種質滲入程度較大，梨品種的演化十分復雜。

本研究應用RAPD分子標記技術對21個梨品種的親緣關系的分析結果與傳統的形態分類結果基本一致。但個別品種間的聚類結果，與實際情況有出入。因此，可以利用此技術與傳統的形態分類相結合，對物種的親緣關系進行有效分析，以便得出更為可靠的結果。