大鼠脂肪干細胞（ｒＡＤＳＣｓ）轉(zhuǎn)運ＶＥＧＦ基因促進隨意皮瓣成活率的研究

魯開化 趙京禹 孫同柱 韓 冰 陳 偉

[摘要]目的：探討人血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF165)基因轉(zhuǎn)染大鼠脂肪干細胞(rADSCs)的穩(wěn)定表達系統(tǒng)對皮瓣成活的影響。方法：①培養(yǎng)和鑒定大鼠ADSCs，脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3．1－VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠(rADSCs)，經(jīng)G418篩選抗性rADSCs并繼續(xù)培養(yǎng)4周，用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清中VEGF濃度。②Brdu標(biāo)記被轉(zhuǎn)染rADSCs后，在大鼠背部制備8．0cm×2．5cm的隨意型皮辦模型，實驗組(10只大鼠)為注射pcDNA3．1-VEGF165質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的rADSCs懸液到大鼠腹腔，對照組(8只大鼠)為注射2ml被空載體pcDNA3．1(一)轉(zhuǎn)染的rADSCs懸液，術(shù)后7天用透明紙描記法記錄皮瓣成活范圍，記數(shù)坐標(biāo)紙格子并換算為成活面積百分率。分別于術(shù)后3天、5天、7天在成活皮瓣的遠端切取皮瓣組織標(biāo)本行免疫組化染色。結(jié)果：①ELISA檢測4株轉(zhuǎn)染和經(jīng)G418篩選抗性并繼續(xù)培養(yǎng)2周的第二代rADSCs上清中VEGF濃度多達(4．21±0．35)pmol VEGF／1×10⁶細胞／48h(x±s，n=4)，有2株細胞培養(yǎng)液上清分泌VEGF較強，其余2株細胞相對較弱，均大于對照的空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組rADSCs培養(yǎng)液上清中的(0．49±0．15)pmol VEGF／1×10⁶細胞／48h(x±s，n=3)和(0．61±0．86)pmol VEGF／1×10⁶細胞／48h(x±s，n=3)，均P<0．01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分泌VEGF較強的rADSCs經(jīng)Brdu標(biāo)記后陽性率達到70％以上。②將獲得的穩(wěn)定表達VEGP165的rADSCs移植到隨意型皮瓣動物模型體內(nèi)，7天后實驗組皮瓣的成活面積為(59．6±0．52)％，大于對照組的皮瓣成活面積(40．5±0．27)％(P<0．01)。成活皮瓣的遠端組織標(biāo)本切片在顯微鏡下可見皮下脂肪中有大量核仁深染棕黃色的細胞。結(jié)論：ADSCs可以作為載體細胞運送VEGF基因到達皮瓣遠端并通過分泌VEGF提高皮瓣的成活面積。

[關(guān)鍵詞]成體干細胞；基因治療；隨意型皮瓣

[中圖分類號]Q789 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01-0007-04

皮瓣是用于修復(fù)較大的組織缺損和外露臟器的帶血供的皮膚軟組織，但是在轉(zhuǎn)移手術(shù)后皮瓣經(jīng)常發(fā)生血運障礙。研究表明，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)可以促進血管的新生，從而提高缺血皮瓣的成活面積。成體干細胞載體可以治療多種疾病。研究表明，MSC等成體干細胞可以作為中樞神經(jīng)性疾病等多種疾病的基因治療載體，例如MSC可以作為VEGF、FGF等多種細胞因子基因治療的載體，并通過旁分泌作用釋放VEGF促進側(cè)支循環(huán)的建立和血管的再生，而MSC自身則不參與缺血組織的治療。目前ADSCs作為基因治療載體的報道較少見，本研究旨在闡明脂肪干細胞可以作為運送VEGF基因到達皮瓣的細胞載體并通過旁分泌VEGF提高皮瓣的成活面積。

1 材料和方法

1．1材料：3周齡SD大鼠18只(雌雄不限)、Lipo-fectamineTM2000(美國Sigma公司)、pcDNA3．1-VEGF165質(zhì)粒(本室構(gòu)建并保存)、DMEME(Dul—beccos modified eagle balancedsalt solution)培養(yǎng)基、0．1％Ⅰ型膠原酶(美國Worthington公司)、CD49天抗體(北京中山生物技術(shù)公司)、恒溫CO₂培養(yǎng)箱、臺式離心機(LingLi公司)、Calibur型四色流式細胞儀(美國Becton Dickinson)、DMIRB型倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

1．2方法

1．2．1 rADSCs的分離和原代培養(yǎng)：SD大鼠麻醉后，在無菌下切取腹股溝脂肪墊，剪碎后加入0．1％Ⅰ型膠原酶消化40～60min，加入2倍體積的D-Hank’s液，離心收集沉淀并用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，轉(zhuǎn)種到培養(yǎng)瓶中。

1．2．2 rADSCs的鑒定：收集處于對數(shù)生長期的第2代rADSCs，95％乙醇固定和漂洗后分別加入鼠抗鼠的CD49天單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗掉未結(jié)合的抗體，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫下放置30min，PBS洗掉未結(jié)合的抗體。用流式細胞儀檢測。同時用PBS／FBS／NANO₃代替一抗作為空白對照。

1．2．3脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)染rADSCs：生長到70％～80％融合的細胞，用新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2遍。按LipofectamineTM2000操作說明，pcDNA3．1(一)、pcDNA3．1－VEGF165質(zhì)粒分別8．0μg和LipofectamineTM2000 20μl混合，室溫靜置20min后，加入1ml不含血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、轉(zhuǎn)染rADSCs 8h后，換成含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，換成最小致死劑量0．5g/L的G418選擇培養(yǎng)基，抗性細胞篩選，2周后細胞克隆形成，其陽性克隆在0．5g/L的G418維持劑量壓力下繼續(xù)擴大培養(yǎng)2周備用。

1．2．4 ELISA檢測被轉(zhuǎn)染rADSCs上清中VEGF濃度：各組rADSCs在培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中VEGF濃度，以平均pmol／1×10⁶細胞／48h(x±s，n＝4)表示。

1．2．5被轉(zhuǎn)染rADSCs的標(biāo)記：在傳代后的細胞培養(yǎng)液中加入新鮮配制的Brdu，終濃度5μg/m1，至細胞生長到95％以上融合后備用。接種在12孔板中的rADSCs在用Brdu標(biāo)記后經(jīng)抗Brdu單抗進行免疫細胞化學(xué)染色，隨機觀察5個視野并計數(shù)。

1．2．6動物實驗：消化收集標(biāo)記Brdu的rADSCs并臺盼藍染色記數(shù)為1×107⁷／ml，用D-Hank’s液反復(fù)3次洗滌，制成2ml的rADSCs的單細胞懸液用于注射動物模型。在大鼠背部一側(cè)制備直徑8×2．5cm的背部隨意型皮瓣模型，掀起皮辦后保留皮下的肉膜。實驗組有10只大鼠，在每只大鼠腹腔內(nèi)注射2ml被轉(zhuǎn)染的rADSCs單細胞懸液，對照組有8只大鼠，在每只大鼠腹腔內(nèi)注射2ml被空載體pcDNA3．1(一)轉(zhuǎn)染的rADSCs單細胞懸液。分別于術(shù)后7天用透明紙描記法記錄皮瓣成活范圍，用數(shù)坐標(biāo)紙格子數(shù)的方法計算成活面積并換算為成活百分率。術(shù)后3天在皮辦遠端切取全層皮膚組織標(biāo)本并用4％的多聚甲醛固定1h，然后用80％到100％的系列梯度的乙醇脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色和抗Brdu免疫組化染色。

1．2．7統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)用x±s表示，t檢驗。

2 結(jié)果

2．1 rADSCs的分離和培養(yǎng)以及鑒定：原代培養(yǎng)的rADSCs在貼壁后細胞形態(tài)均一，呈梭形的單層成纖維細胞樣。流式細胞學(xué)檢查示第3代rADSCs均一性較好，CD49天陽性率為95．3％。

2．2細胞轉(zhuǎn)染與篩選效果：經(jīng)轉(zhuǎn)染和G418篩選后，非轉(zhuǎn)染組的和pcDNA3．1(一)空載體轉(zhuǎn)染組的細胞100％死亡，而pcDNA3．1－VEGFl65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細胞在篩選約2周后有數(shù)量較多的細胞集落，提示克隆化基因的細胞轉(zhuǎn)染及G418篩選效果良好。

2．3 ELISA檢測轉(zhuǎn)染后細胞上清中VEGF濃度

2．4動物實驗中大白鼠在手術(shù)后生命體征平穩(wěn)，精神好，進食和飲水均好。術(shù)后7天，各組皮瓣的成活面積如下(表3、圖1)，術(shù)后3天皮瓣遠端皮膚組織抗Brdu免疫組化染色(圖2)。

3 討論

脂肪組織的基質(zhì)成分中含有具有自我更新和多能分化潛能的脂肪干細胞(adipose derived stemcells，ADSCs)，我們以往的研究結(jié)果表明脂肪組織可以促進皮膚創(chuàng)面的愈合。由于脂肪組織來源廣泛，取材方便，可以獲得的基質(zhì)細胞數(shù)量大，所以可以作為替換MSC來源的成體干細胞。ADSCs和MSC之間CD標(biāo)記的區(qū)別是ADSCs表達CD49天，本實驗通過流式細胞學(xué)對培養(yǎng)的rADSCs表面抗原CD49天陽性的檢測確證和鑒定了培養(yǎng)的細胞是ADSCs。

pcDNA3．1－VEGFl65重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細胞經(jīng)G418篩選后出現(xiàn)數(shù)量較多的細胞集落，而非轉(zhuǎn)染組的細胞100％死亡，提示VEGF基因轉(zhuǎn)染細胞的效果和G418篩選細胞的效果都良好。ELISA檢測轉(zhuǎn)染后細胞上清中VEGFl65濃度隨時間而升高，而非轉(zhuǎn)染組和pcDNA3．1(一)空載體轉(zhuǎn)染組的細胞上清中VEGFl65濃度較低，提示VEGF165在rADSCs中有效表達，并被正確修飾，rADSCs可以作為基因治療中的載體細胞。因此，理論上可以將獲得的穩(wěn)定表達VEGF165的rADSCs移植到體內(nèi)實施基因治療。

Brdu是常用的一種標(biāo)記細胞核的熒光染料。注入到腹腔的被轉(zhuǎn)染rADSCs的Brdu標(biāo)記細胞陽性效率可達70％以上，臺酚藍染色記數(shù)注入到腹腔rADSCs為1×10⁷，較高的Brdu標(biāo)記率和充足的細胞數(shù)量是rADSCs在本移植實驗研究中作為皮瓣基因治療載體細胞的前提。

隨意型皮瓣是常用于研究皮瓣成活能力的模型。本實驗選用大鼠背部的8cm×2．5cm隨意型皮瓣模型，皮瓣遠端由于超出長：寬＝1：1．5的比值范圍，因而是血流供應(yīng)較少的部位，在手術(shù)后局部出現(xiàn)血流緩慢，內(nèi)皮細胞缺氧脫落和血栓形成等一系列的病理生理學(xué)改變，最終導(dǎo)致遠端超出血流供應(yīng)范圍皮辦的缺血壞死。本研究結(jié)果表明，實驗組皮瓣的成活面積(59．6±0．52)％，大于對照組的皮辦成活面積(40．5±0．27)％，P<0．01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明被轉(zhuǎn)染的rADSCs可以通過分泌VEGF165促進隨意型皮瓣的成活。

標(biāo)本Brdu免疫組化染色結(jié)果顯示注入到大鼠腹腔的rADSCs在術(shù)后3天即可以見到通過血液循環(huán)到達背部皮瓣遠端的皮下脂肪組織，術(shù)后5天、7天有類似的結(jié)果，這提示我們注入到大鼠腹腔的rADSCs具有早期向遠離注射部位的皮瓣遷移的生物學(xué)特點，提示rADSCs可以作為運送VEGF基因到達皮瓣的載體，并通過旁分泌作用釋放VEGF165促進側(cè)支循環(huán)的建立和血管的再生，改善皮瓣組織的血供。提示rADSCs作為運送治療基因的載體細胞提高皮瓣成活的可能性。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。