ＳＤ大鼠糖尿病創面與正常創面中ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３的表達差異

徐 蓉 范 斌 徐文彬 金 偉 肖秀麗 王一飛

[摘要]目的：通過觀察大鼠正常創面與糖尿病模型創面肉芽組織中／GF－β1、TGF－β3不同時段表達水平的差異，探求糖尿病創面“難愈”的可能機制。方法：采用SD大鼠實驗性正常創面及糖尿病創面背部全層皮膚缺損模型，分別于不同時段(3天、7天、11天)取材，EnVision二步法免疫組化測定，并行圖像掃描定量分析TGF-β1、TGF-β3水平變化。結果：創傷后3天、7天和11天，正常創面模型組TGF-β1表達分別為(25．56±6．86)、(24．79±5．62)和(28．57±6．39)，TGF-β3表達分別為(39．69±5．46)、(23．20±2．45)、(13．69±3．63)。而糖尿病潰瘍模型組TGF-β1表達分別為(7．10±3．74)、(9．47±1．72)和(7．87±2．53)，TGF-β3表達分別為(14．99±1．87)、(18．72±5．01)和(8．68±3．39)。糖尿性創面肉芽組織中各時段(3天、7天和11天)TGP-β1及TGF-β3表達水平均低于正常創面組(P＜0．05)。結論：SD大鼠糖尿病創面TGF-β1及TGF-β3的低水平表達，可能是創面愈合遲緩的原因之一。

[關鍵詞]糖尿病：創面愈合；TGFβ

[中圖分類號]R641 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0035－03

TGF－β是參與創面愈合全過程的重要因子，近來有國內外研究表明：創面難以愈合往往和生長因子的缺乏有關。我們以SD大鼠實驗性正常創面與糖尿病潰瘍模型為研究平臺，動態觀察不同時段新生肉芽組織中TGF－β₁、TGF－β₃水平的變化，從生長因子水平闡明糖尿病性創面的部分機制。

1 材料和方法

1．1實驗動物及分組：48只清潔級SD(sprague-dawly)大鼠，雄性，質量(250±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供(批號醫動字第04-20-3號)。糖尿病造模后隨機分為3天、7天和11天三個觀測時段。每個時段又分為正常創面生理鹽水組、糖尿病創面生理鹽水組。每組各8只動物。

1．1．1主要實驗試劑和儀器

1．1．2大鼠創面模型制備用藥：新潔爾滅酊，0．9％生理鹽水(上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院提供)。0．1％鹽酸氯胺酮(上海中西藥業股份公司產品)。四氧嘧啶(Auoxan)，試劑編號：2244-11-3。瑞士FULKA公司產品(由上海中醫藥大學藥理毒性實驗室提供)。羅氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖儀和血糖測試試紙，編號：2005—10，22896931，瑞士Roche公司產品。 1．1．3免疫組化試劑和儀器：轉化生長因子β₁多克隆抗體，工作濃度1：200；轉化生長因子β₃多克隆抗體，工作濃度1：200，均為北京中山生物工程公司產品；二抗抗體(生物素標記的羊抗兔抗體)，工作濃度1：200，美國Vector公司產品。EnVision試劑盒，工作濃度1：100，日本DAKO公司產品。3，3-二氨基聯苯胺(DAB)，瑞士Fluke公司產品；BX51／BX52系統顯微鏡，日本Olympus公司產品。SX-100計算機圖像分析系統，美國IBM公司產品。

1．2方法

1．2．1動物實驗(上海中醫藥大學岳陽中西醫結合醫院動物實驗室)

1．2．2糖尿病大鼠模型制備：糖尿病大鼠模型制備參照傅小兵等方法改進動物隨機分為對照組和實驗組，禁食24h后(飲水不限)，分別在乙醚麻醉下尾靜脈一注射1．5％四氧嘧啶(50mg／kg，實驗組)及等體積生理鹽水(對照組)，造模后4h后給予5％葡萄糖水溶液飲用，次日經尾部取血測血糖，血糖值大于10mmol／L上，則表明造模成功。模型制成后，實驗組再隨機分三組，每三天測血糖一次，直到動物處死。

1．2．3動物糖尿病創面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后三天，參照傅小兵等方法改進，SD大鼠用1％鹽酸氯胺酮(0．3ml／100g)腹腔注射麻醉。局部備皮，常規消毒后，于SD大鼠背部取直徑為3cm左右圓形切口，剪開皮膚全層，至皮下筋膜，無菌敷料加蓋，每日換料一次。

1．2．4動物標本采取：用藥后第3天、7天、11天，將動物麻醉(氯胺酮)處死，用眼科手術剪分離新生創面肉芽組織，并成塊取下，為所需實驗樣品。

1．2．5免疫組化實驗：(上海復旦大學腫瘤醫院病理實驗室和上海中醫藥大學藥理毒性實驗室)6組(3個吋段，每個時段分2組)標本均用10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，每例分別進行HE染色。(用以對照病理診斷)，并同時、同一試劑進行免疫組化EnVision二步法測定／FGβ1、TGFβ3。

1．2．6EnVision二步法測定：取存檔蠟塊制成5μm連續切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。將切片移入電飯煲水浴中(內含0．01mol／1 Ph6．0的檸檬三鈉緩沖液)，溫度保持在95～100℃，煮20min，保溫10min，進行抗原修復，取出后在室溫下自然冷卻。TBS洗滌，5min3次。滴加一抗(分別為上述抗體及相應抗體稀釋度)在濕盒中室溫下(20℃～25℃)孵肓60min后移入4℃冰箱過夜。TBS洗滌3次。滴加EnVision反應液(抗鼠，抗兔)，50μl／片，室溫下孵育30min。TBS洗滌3次。0．05％DAB+0．03％H₂0₂顯色5～10min。流水洗，蘇木素襯染，鹽酸酒精分化，藍化。遞增梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規樹脂封片。對照設置：顯微鏡下觀察：有棕黃色染者為陽性對照，用TBS代替一抗做陰性對照。

1．2．7免疫組織化學陽性著色的定量分析：染色結果應用Image-pro plus 4．1版本計算機圖像分析系統在40倍顯微鏡下計算區域的陽性面積百分比(％)，求出10個視野平均值(x±s)。統計學處理采用SPSS11．0統計軟件包對相關數據進行配對資料均數的雙側t檢驗，P＜0．05，具有統計學意義。

1．2．8創面面積：采用透明薄膜稱量法。創傷后3天、7大、11天，分別用透明薄膜覆蓋創面沿創緣畫膜，剪膜，置分度值為0．1mg的電子天平稱取質量并轉換成面積。

2 結果

各治療組不同時段TGF-β1、TGF-β3水平變化詳見表1、2、3。

從以上實驗結果可以看出，三個不同時段(3天、7天、11天)，糖尿病創面生理鹽水組均低于正常創面生理鹽水組(P＜0．05)。

3 討論

糖尿病是臨床常見病、多發病。糖尿病性潰瘍，特別是足部潰瘍發病率較高，是糖尿病患者的常見并發癥之一。造成糖尿病潰瘍遷延難愈的原因有很多，可能和局部生長因子缺乏，細胞外基質改變，成纖維細胞功能降低，白細胞的抗菌活性降低和患處體循環、微循環紊亂等有關。其中對生長因子的研究，是目前創面愈合的研究熱點。

創傷修復的快慢取決于修復細胞進入傷口和增生的速度，而細胞的進入和增生又依賴于趨化因子和生長因子的參與。轉化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是近來創面愈合研究中的熱點。它是創面細胞外基質積聚過程中的主導介質，通過激活細胞內smad2和smad3介導的信號通路，誘導細胞內目的基因表達和蛋白合成。

在哺乳類動物中，有三種子GF-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。它們彼此的分子結構不盡相同，結合細胞受體的方式也不同，但卻有著相似的生物學活性，對諸如細胞分化、增殖、細胞黏附、骨骼形成、血管生成、炎癥反應和創面愈合的調控在生物學方面有著舉足輕重的影響。有研究證實TGF-β既可直接作用于成纖維細胞對細胞外基質的蛋白合成，體外低濃度的TGF—β即可刺激成纖維細胞合成大量膠原基質。已有研究表明：糖尿病創面通常表現為修復不足，通過增加TGF-β1的合成與釋放，可以增加糖尿病燒傷創面的血管形成，促進創面愈合。

我們的實驗結果顯示：糖尿病創面的生理鹽水組在傷后3～11天的創面中TGF-β1、TGF-β3的表達量始終較低，3天和11天比較幾乎沒有明顯變化(P＜0．05)。而創傷后3天內TGF-β3水平高于TGF=β1(P＜0．05)，可能和創傷后應激反應有關，與文獻報道相一致。正常創面組，在創傷后3～11里，TGF-β1一直保持在較高水平，TGF-β3隨創面愈合而逐漸下降。正常創面組TGF-β1水平始終高于糖尿病性創面組。研究結果顯示糖尿病性創面難以愈合的原因可能與低水平表達的TGF-β有關。

編輯／張惠娟

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