人臍血內皮祖細胞體內促進血管重建的實驗研究

[摘要]目的：通過觀察人臍血內皮祖細胞(EPC)在裸鼠體內缺氧狀態下分化成內皮細胞的現象，初步研究其促進血管重建的作用。方法：根據EPC表面標記CDl33，采用免疫磁珠法分離培養EPC。設計EPC裸鼠成瘤實驗，觀察瘤體內血管增生情況；將熒光標記的EPC注射于裸鼠腹部皮辦中，觀察EPC參與皮辦血管重建情況；將EPC接種于聚羥基乙酸(PGA)中，移植于裸鼠皮下，觀察EPC參與血管重建。結果：原代EPC貼壁后呈梭形，從第7天開始數量明顯增加，呈克隆狀生長。透射電鏡觀察到成熟內皮細胞最具特征性的細胞器——Weibel－—Palade小體。裸鼠成瘤實驗：抗人vWF免疫熒光顯示大量EPC參與腫瘤血管生成；裸鼠皮辦實驗：熒光標記EPC參與裸鼠皮辦血管生成；PGA移植實驗：抗人vWF免疫酶組織化學染色顯示EPC參與血管生成。結論：EPC參與血管重建，具有促進血管新生，加速缺血組織血管化的作用。

[關鍵詞]血管內皮祖細胞；CD133(AC133)：免疫磁珠

[中圖分類號]Q254 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0015－04

一般認為內皮祖細胞(endothelial progenitor Cell，EPC)僅見于胚胎時期，但近年來，越來越多的證據表明在成年個體中也存在少量的EPC。1997年ASahara等報道在成人外周血中分離出EPC，體外培養呈梭形，具有形成管腔樣結構的能力，且能夠表達成熟內皮細胞的特異性抗原，在動物實驗中可參與新生血管的形成，此后，又陸續觀察到骨髓和臍帶血中均存在EPC。EPC具有促進血管新生，加速缺血組織血管化的作用。本實驗采用免疫磁珠法從人臍血中分離培養EPC，觀察EPC在體內缺氧條件下分化成內皮細胞，并參與血管生成，為治療性血管發生研究及組織器官移植提供種子細胞。

1 材料和方法

1．1主要試劑及標本來源：胃癌GC7901細胞株由第四軍醫大學實驗動物研究中心細胞庫提供)；ACD—B抗凝液(上海市血液中心)：1．077淋巴細胞分離液(天津TBD公司)；免疫磁珠試劑盒(挪威DYNAL公司)；Fibronectin(美國Sigma公司)：異硫氰酸熒光素(FITC)CDl33單抗(美國RD公司)；抗人vWF單抗(英國Serotec公司)；F1RC－二抗及辣根過氧化物酶標記二抗、CD34單抗(丹麥DAKO公司)；EGM-2MV培養基(美國Cambrex公司)；細胞熒光染色試劑盒(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit，Sigma，美國)；人纖維蛋白原(Fibronogen，Sigma，美國)：人凝血酶(Thrombin 500，IMMUNO AG，奧地利)：PGA真皮替代物(NEOVEIL，日本)。BALB／c，nu／lnu裸小鼠15只，雌雄不限，鼠齡4～6周，體重18～23g(第四軍醫大學實驗動物研究中心)；人臍血標本來源于本院34例婦產科健康產婦(產婦均知情同意)。

1．2 EPC分離及誘導分化培養：ACD-B抗凝臍血，1：2加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，取7ml緩慢加入3ml淋巴細胞分離液，621×g離心30min，取單個核細胞層，PBS洗滌3次去血小板。免疫磁珠與FITC-CDl33單抗室溫孵育30min，PBS洗去多余單抗。將包被FITC-CD133的免疫磁珠加入單個核細胞中，室溫孵育30min，置于磁場中1min，棄細胞懸液，參照免疫磁珠試劑盒說明書分離出CD133⁺細胞。加入EGM-2MV培養基(hEGF，Hydrocortisone，VEGF，FGF-B，R3－IGF－1)，接種于包被Fibronectin的25cm²培養瓶中，37℃，飽和濕度培養。24h換液除去未貼壁細胞，3天后半量換液，培養3～4周。檢測指標：①原代EPC的生長曲線：細胞以5×10³個／孔的密度接種于96孔板。1～19天，隔日隨機抽取4個培養孔，噻唑藍(MTT)法測定各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線。設不加細胞只加培養液為空白對照。②CDl33^＋細胞分化：培養5天、10天的細胞分別加入FITC-CDl33單抗、CD34單抗、vWF單抗，室溫孵育30min，PBS洗去多余單抗。加入辣根過氧化物酶標記二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色；取培養10天的細胞。③行透射電鏡觀察找Weibel-Palade小體。

1．3裸鼠成瘤實驗：常規方法復蘇、培養將胃癌GC7901細胞。取1×10⁶個／1001×1原代培養EPC與1×10⁶個／100μl胃癌GC7901細胞混合接種于裸鼠背部皮下。30天過量麻藥腹腔注射處死裸鼠，取出腫瘤。40g／L多聚甲醛固定12h，常規石蠟切片vWF免疫組化染色。觀察瘤體內EPC參與構成血管情況。

1．4裸鼠皮辦實驗：取5×10⁶EPC，90g(800rpm)，離心5min棄上清，加入稀釋液(Diluent C)0．5ml，重懸取1μl PKH26熒光染液，迅速加入細胞懸液中室溫孵育2～5min。加入1ml RPM11640／10％FBS培養基中止染色，調整細胞濃度為1×10⁶／ml，熒光顯微鏡下觀察。采用0．3％戊巴比妥鈉腹腔麻醉。裸鼠腹腔注射0．5～0．7ml，3～5min麻醉生效后，根據設計于腹部肉膜層與深筋膜的淺面之間，將皮瓣仔細掀起，熒光標記EPC單細胞懸液100μl(1×10⁵)，分成3點(遠點、中點、蒂部)經皮辦軟組織面均勻皮下注射于皮瓣。術后7天，過量麻藥腹腔注射處死裸鼠，于皮辦中段切取組織，大小1．0cm×0．5cm。①細胞示蹤：行冰凍切片，采用570nm波長，熒光顯微鏡觀察。②常規石蠟切片vWF免疫組化染色，觀察EPC參與構成血管情況。

1．5取對數生長期EPC及成纖維細胞與纖維蛋白原溶液(5g/L)按1：2：3混合，加入PGA材料(預先加入20u／40μl凝血酶)，37℃放置10min，混懸液便形成凝膠狀固定于網孔中，加入EGM-2MV培養基培養。培養48h后，移植于裸鼠背部皮下。于裸鼠移植后21天取材，4％多聚甲醛固定。常規石蠟切片，vWF免疫酶組織化學染色，鏡檢。

2 結果

2．1 EPC傳代培養后，細胞形態及密度均勻，前3天為相對抑制期，此后呈指數形式快速增殖，10天后達到80％～90％融合。EPC生長曲線(圖1)顯示：人臍血EPC接種后5天內細胞數量無明顯增加，從第7天開始細胞數量明顯增加，在第16天達到最高峰，以后增殖趨于平緩。

2．2原代EPC貼壁緩慢，24h后懸浮細胞重新接種培養仍有細胞貼壁生長。EPC在Fibronectin包被的培養皿中培養24h后，可見到部分圓形大單核細胞粘附于培養瓶底，3天后細胞貼壁完全，少量細胞開始伸展，隨著誘導培養時間的延長，圓形細胞逐漸減少，梭形細胞數量逐漸增多。7天左右出現由十數個細胞形成的細胞集落，可見20～30或更多數目細胞排列成內皮細胞特異性條索狀結構或網格狀結構。10天后形成明顯克隆，并有梭形貼壁細胞從其邊緣不斷生成，2～3周，細胞長滿培養瓶底，單層細胞呈多角形融合成片狀(圖2)。

2．3原代培養第10天細胞透射電鏡顯示：人臍血EPC平均直徑15μm，核／漿比例大。細胞膜伸出許多偽足絲，基底膜呈多層。胞漿內可見一種短棒狀小體，含平行管狀的內部結構，即Weibel-Palade小體(圖3)，是內皮細胞最具特征性的細胞器。

2．4 5只裸鼠接種細胞7天后均見腫瘤快速生長，抗人vWF免疫熒光組織化學染色顯示大量EPC參與腫瘤血管構建(圖4)。

2．5 EPC參與皮辦血管重建的觀察：通過實驗室體外培養，證實染色后細胞增殖活性無明顯變化，在熒光顯微鏡下可以清楚地辨別細胞的輪廓，染料在細胞膜上分布均勻一致。通過移植后7天皮瓣中段真皮下層熒光顯微鏡觀察，發現皮辦真皮下層存在能激發出紅色熒光的細胞，多呈散在分布，或呈條索狀分布(圖5)，偶可見管狀結構。并通過抗人vWF免疫酶組織化學染色，進一步證實EPC確實參與皮辦血管重建(圖6)。

2．6 EPC、成纖維細胞與纖維蛋白原混懸液與凝血酶混合后，數秒鐘后即形成膠凍狀，數小時后可見細胞均勻分布于真皮支架的各個層面，并逐漸伸展為梭形或多極狀，貼附于PGA支架纖維材料上(圖7)，隨培養時間的延長，細胞呈簇狀聚集生長。移植21天，真皮替代物支架中的孔隙已完全被細胞和細胞外間質填充，支架部分降解，被大量平行排列的新生膠原纖維所替代，可見大量新生小血管形成，vWF免疫酶組織化學染色陽性(圖8)，表明種植的EPC具有生物學活性，參與血管化過程。

3 討論

內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)是一類能循環、增殖并能直接分化為血管內皮細胞(endothelial cells，EC)，但尚未表達成熟血管內皮細胞表型的前體細胞。以前認為EPC僅僅出現于胚胎血管發育階段，在人出生后，并不存在EPC。但最近研究發現在臍帶血、成人外周血、骨髓中的CD34^＋細胞或flk 1⁺細胞或CD133+³細胞離體培養兩周后均能分化為內皮細胞，從而證實成年個體中存在EPCI3-41。并且經異體骨髓移植模型證實，成年個體外周血中的EPC來源于骨髓，在受到血管內皮生長因子(VEGF)、粒細胞／巨噬細胞集落刺激因子(G／M-CSF)等細胞因子以及缺氧刺激后可加速動員入外周血。在動物后肢缺血模型及大鼠急性心肌梗死模型中，人外周血、臍帶血和骨髓來源的EPC移植均取得了很好的療效。為臨床缺血性疾病的血運重建提供了一種新的治療策略。

目前對EPC發育分化的機制尚不十分清楚。EPC從原血干細胞而來，定向分化為內皮細胞，在此分化發育過程中，flk1是最先表達的內皮標志，其次是PECAM和Tie2的表達。成人外周血中的CD34⁺／ACl33⁺／flkl⁺EPC體外培養分化為成熟內皮細胞過程中，干細胞標志ACl33⁺逐漸下降，2周后完全消失，表明EPC是從原血干細胞到內皮細胞過程中的一個過渡的轉瞬即逝的細胞表型階段，隨著系列定向和分化成熟，在某些基因的調控下，細胞表型逐漸改變。目前尚未發現EPC的特異性表面標記物，CD133是新近發現的干細胞標記，其表達在造血干／祖細胞分化過程中迅速下調，而不表達于CD34^-群體。更重要的是CD34⁺／VEGFR-2⁺的細胞均表達CD133，這就使CD133成為富集EPC的理想細胞標記。

本實驗采用免疫磁珠法從人臍血中分離培養CDl33⁺血管內皮祖細胞，通過CD133、CD34、vWF以及透射電鏡對不同時期的細胞進行鑒定，證明此CD133⁺血管內皮祖細胞具有分化為成熟血管內皮細胞的能力。并通過裸鼠成瘤實驗、皮辦實驗及PGA移植實驗證明EPC參與生成，具有促進血管新生，加速缺血組織血管化的作用。

編輯／張惠娟

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