不同凍存方法對組織工程骨生物活性的影響

[摘要]目的：了解不同凍存方法對組織工程骨生物活性的影響。方法：以骨髓基質干細胞(ma¨ow stromal cell s，MsCs)復合部分脫蛋白骨培養制備組織工程骨，實驗分為A組：組織工程骨用添加凍存保護劑的保存液保存；B組：組織工程骨用不添加凍存保護劑的保存液保存；c組：組織工程骨未行低溫保存；D組：單純Mscs培養。A組和B組的組織工程骨于一196℃的液氮中凍存3個月，3個月后復溫凍存的組織工程骨。用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察Mscs的粘附和分布情況、檢測細胞活力和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、流式細胞儀分析細胞周期。結果：Mscs在材料表面和孔隙內均可粘附和分布，粘附于材料的細胞活力大小依次為：c組>A組>B組 (P<0．01，pA組>B組(P

[關鍵詞]組織工程；骨髓基質干細胞；脫蛋白骨；生物活性

[中圖分類號]R318．08 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)02—0147－04

目前，國內外骨庫對于異體骨和異種骨的保存積累了豐富的經驗，但對于組織工程骨的保存卻是一個空白點。相對于異體骨和異種骨的保存，組織工程骨的保存需要更為嚴格的標準。如何使保存后的組織工程骨具有較好的生物活性，需要進行相關研究。

1材料和方法

1．1部分脫蛋白骨支架材料的制備：取腦死亡患者捐獻尸體骨的干骺端，修整為1．5cm×0．5cm×0．3cm大小。材料一側為皮質骨，另一側保留部分松質骨，共24塊。生理鹽水反復沖洗，一70℃深低溫冰箱冷凍后，經脫脂、脫細胞和部分脫蛋白處理，冷凍干燥機凍干。材料用雙層血漿袋密封包裝，環氧乙烷消毒，4℃冰箱冷藏保存。

1．2組織工程骨的制備：取健康新西蘭白兔2只，雙側脛骨結節處備皮消毒，無菌條件下用骨穿針穿刺抽取紅骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培養液(Gibco公司)，混勻后加入3ml淋巴細胞分離液(Gibco公司)，1800r／min離心lOmin，吸除中間層細胞后再離心，所得細胞沉淀以1×10⁶／ml密度接種于含15％胎牛血清的DMEM培養液中，于37℃、5％C0₂飽和濕度條件下培養。待細胞相互融合達90％生長面積時用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化傳代培養。細胞傳至3代時，移入含l×10^-8mol／L地塞米松、50mg／L維生素C和l×10^-2mol／L B-磷酸甘油鈉的DMEM培養液誘導培養3天，誘導后的細胞表型經鑒定為成骨樣細胞。將支架材料用DMEM培養液浸泡l天后棄殘液，每個支架材料以1×10⁶／m1密度接種經誘導培養的MSCs，于37℃、5％C0₂飽和濕度培養7天。

1．3實驗分組和組織工程骨的低溫保存：實驗分為A組：組織工程骨用添加凍存劑的保存液保存；B組：組織工程骨用不添加凍存劑的保存液保存；C組：組織工程骨未行低溫保存；D組：單純MSCs培養。以含15％胎牛血清DMEM培養液為基本保存液，凍存保護劑的基本成分為一二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、羥乙基淀粉和蔗糖，按照一定的比例合理搭配。具體降溫步驟如下：將組織工程骨分裝入含不同保存液的凍存管內，室溫下放置10～15min，然后置于4℃ 20min，以－1℃／min降溫至－20℃，保存30min，再以－1℃／min降溫至80℃，隔夜后直接放入液氮中保存。3個月后取出凍存管，快速置于37℃水浴1～2min，直至保存液完全融化。

1．4倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察：用倒置相差顯微鏡觀察細胞與材料的粘附，細胞在材料孔隙內的分布。各組取組織工程骨1塊，PBS漂洗三遍，戊二醛固定，酒精梯度脫水，標本經干燥和噴金處理后，用掃描電鏡觀察細胞在材料表面的粘附和分布。

1．5 MTT法檢測細胞活力：各組取組織工程骨6塊，于培養板中加入5mg／ml的MTT，反應4h后棄液，加入DMSO，振蕩lOmin，用酶標儀(美國PerkinElmer公司)選擇波長490nm讀取光密度值(0D值)，分析細胞活力。

1．6 ALP活性檢測：各組取組織工程骨6塊，消化并收集細胞。采用對硝基苯磷酸法，用紫外／熒光／可見光高效分析儀(美國Perkin Elmer公司)測定ALP活性，了解細胞產生的ALP活性。

1．7流式細胞儀檢測：各組取組織工程骨6塊，消化收集細胞并計數，PI染液染色，用流式細胞儀(美國Coulter公司)檢測細胞周期和DNA含量，計算DNA指數(DI值)。

1．8統計學方法：實驗結果以x±s表示，采用SPSS10．0軟件包對組間計量資料行方差分析和q檢驗，P

2結果

2.1倒置相差顯微鏡觀察結果：各組細胞在材料表面和孔隙內均可粘附和分布，細胞與材料緊密粘附，聚集成團，相互連接成網狀(圖1a～c)。其中，A組和C組材料孔隙內分布大量細胞，B組材料孔隙內分布少量細胞。觀察結果提示，A組和c組組織工程骨的生物活性優于B組。

2．2掃描電鏡觀察結果：各組細胞在材料表面均可粘附，呈梭形或多角形，相鄰細胞間有突起相互連接，細胞周圍有網狀膠原附著。其中，A組和C組材料表面粘附大量細胞，并有較多膠原連接；B組材料表面粘附細胞較少，膠原連接很少(圖2a～c)。 觀察結果提示，A組和C組組織工程骨的生物活性優于B組。

2．3 MSCs活力檢測：粘附于材料的細胞活力分別為：A組0．5336±0．0122，B組0．3872±0．0052，C組0．6239±O．0047，D組0．7026±0．01973，細胞活力大小依次為C組>A組>B組，各組問差異均有統計學意義(P

2．4 MSCs ALP活性檢測：粘附于材料細胞的ALP活性分別為：A組為(0．756±0．029)u／L，B組為(0．423±0．046)U／L，C組為(O．837±0．015)U／L，D組為(1．001±0．097)u／L，細胞的ALP活性依次為C組>A組>B組，各組間差異均有統計學意義(Jp<0．01)。

2．5流式細胞儀檢測細胞周期：每塊材料粘附細胞數分別為：A組(2．35~0．21)×105，B組(1．26~0．39)×10⁵，C組(3．25±O．18)×IOs，D組(5．38±0．19)×10⁵，每塊材料粘附細胞數的多少依次為c組>A組>B組(P<0．01)。各組細胞周期未見明顯變化，無異倍體細胞，見表l。

3討論

低溫凍存是保存活體組織的重要方法，冷凍損傷是活體組織細胞最主要的副反應。損傷機制主要是凍融時冰晶對細胞的機械性和滲透性損傷，表現在以下兩個方面：①慢速冷凍過程中，細胞外液水分不斷結晶造成游離水分減少，導致細胞內外滲透壓不等，使得大量水分由細胞內向細胞外滲出，逐漸導致細胞內滲透壓升高，造成“溶質性損傷”；②快速冷凍過程中，細胞內水分尚未轉移到細胞外，而細胞內外同時結冰，細胞內冰晶機械性破壞細胞器和細胞核而導致細胞損傷，造成“細胞內冰晶損傷”。目前認為生物組織的冷凍損傷主要是“溶質性損傷”所產生的滲透壓、電解質含量和pH值的改變作用于細胞膜脂質造成的細胞膜滲漏，在復溫過程中，細胞膜滲漏使大量水分進入細胞內導致細胞水腫而死亡，稱為滲透性休克。此外，復溫過程中如復溫速率較慢，則會再次形成冰晶加重細胞損傷。有研究表明氧自由基也是導致凍融細胞損傷的原因之一，在冷凍前應用氧自由基保護劑可減輕冷凍損傷。由于冷凍速率越快引起細胞內冰晶形成越多，而速率過慢又可導致“溶質性損傷”。因此，低溫保存需要選擇造成損傷最輕的降溫速率。復溫速率對低溫保存后細胞活力的恢復也有很大影響，嚴格說復溫過程是降溫過程的逆函數。如果沒有足夠快的復溫速率，細胞內再次形成冰晶的概率很高。為了減輕冷凍損傷，選擇適宜的降溫和復溫速率是低溫保存的一個關鍵環節。分階段降溫比勻速降溫對細胞活力和功能影響小，因此本實驗采用分階段降溫措施，降溫速度1～1．5℃／min，3個月后快速復溫，較好的保持了凍存細胞的活力和功能。

凍存保護劑是減少冷凍損傷的另一個重要方法，其保護機制可能是防凍劑與水分子形成氫鍵，使最低共熔點降低，從而減輕或避免了冷凍復溫過程中冰晶對細胞的損傷。由于各種凍存保護劑的作用機制不同，單一保護劑很難達到效果理想的冷凍保護要求，目前常采用多種凍存劑組成的混合保護劑。本實驗采用含15％胎牛血清的DMEM培養液為基本保存液，凍存保護劑的基本成分為DMSO、羥乙基淀粉和蔗糖，3種成分按照一定濃度和比例合理搭配。DMSO具有膜通透性好和滲透性強等特點，有助于細胞克服低溫保存過程中細胞內外滲透壓劇烈變化引起的損傷，是目前最常采用的凍存保護劑。其作用機制是：DMSO在細胞冷凍前滲透到細胞內，可降低培養液冰點并防止游離蛋白質聚集，提高細胞膜對水的通透性。水分在凍結前滲透出細胞外形成冰晶，從而減少細胞內冰晶形成，提高細胞復蘇后存活率；冷凍前滲透到細胞內的DMSO在細胞內外產生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質損傷，同時細胞內水分不會過度外滲，避免細胞結構過度脫水皺縮。羥乙基淀粉通過競爭結合水的氫原子，使冰晶生成速度減慢，減弱水的固化過程，可以降低細胞外溶質濃度過高造成的細胞損害。低分子不可滲透物質蔗糖能在降溫時向細胞外轉運細胞內溶質，而復溫時則作用相反，從而減輕細胞滲透性損傷。雖然凍存保護劑具有保護作用，但也有一定毒性，其毒性機制可能是：通過細胞膜引起的滲透性損傷、與蛋白質和脂膜結合導致其變性的化學性損傷，毒性損傷與溫度和凍存劑的含量有關。目前對于混合性凍存劑的研究主要是尋找對相應組織和細胞具有保護效果最佳、毒性最小、不同種類和不同含量凍存劑的組合。本實驗采用DMSO、羥乙基淀粉和蔗糖混合物為組織工程骨的凍存保護劑，結果添加凍存劑組與不添加凍存劑組相比較，細胞周期未見明顯變化，無異倍體細胞出現，復溫后的組織工程骨生物活性得到了極大程度的改善，但與未行低溫保存的新鮮組織工程骨相比較，其生物活性尚有一定的距離。因此，保存組織工程骨所應用的降溫復溫程序和速率、凍存劑含量和配方的選擇如何才能做到最佳，并且方法簡便、經濟和實用，這些均有待于進一步研究。

編輯／張惠娟

(注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。)