復合骨髓間充質干細胞的組織工程皮膚修復燒傷創面的實驗研究

[摘要]目的：探討用復合骨髓間充質干細胞(MSCs)的組織工程皮膚修復燒傷創面的可行性。方法：利用自行研制的燙傷儀制備燙傷創面，以MSCs為種子細胞構建組織工程皮膚修復燙傷創面，觀察愈合時間和收縮率等。結果：移植2周后實驗組創面基本愈合，表皮角質化，真皮層毛細血管增生，6周后創面收縮到原始面積的61％。結論：含有MSCs的組織工程皮膚移植后促進了燒傷創面的愈合，獲得了較理想的愈合效果，為臨床治療提供了新的思路。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；創傷愈合；組織工程；動物模型；燒傷

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-64 55(2007)04-0437-03

皮膚燒傷是臨床常見病癥之一，大面積燒傷時僅靠創面自身難以實現皮膚的再生，需要足夠的皮膚替代物進行修復。隨著組織工程(tissueengineering，TE)技術研究的進一步深入，TE皮膚在體外得以成功構建并初步應用于臨床，標志著皮膚缺損治療的重大突破，具有廣泛的應用前景。近年來，骨髓來源的骨髓間充質干細胞(mesenchymalstem cells，MSCs)因具有來源廣泛、取材方便、增殖快、分離培養容易等優點，已成為組織工程研究中常用的種子細胞。本研究將MNCs體外培養擴增，以膠原凝膠為支架材料構建組織工程皮膚，并用于皮膚燒傷缺損的治療。

1 材料和方法

1．1 骨髓間充質干細胞的分離培養：無菌條件下從豬髂骨處抽取骨髓，采用Percoll(SIGMA)分離法，經密度梯度離心收集界面層的單個核細胞，PBS洗兩次，離心收集細胞，重懸于體積分數為100ml/L胎牛血清的DMEM/F12培養液進行培養，隔日換液，棄去未貼壁的細胞，待貼壁細胞繼續培養達80％-90％融合時，用胰蛋白酶消化，傳代培養。

1．2 構建含有MSCs組織工程皮膚：取用3-5代狀態良好的骨髓問充質干細胞，以1.8×10⁶/ml的密度與提取自小牛皮的Ⅰ型膠原混合，37℃孵育30rain凝固后，加入培養液培養2天，隔天換液；在其表面以1×10⁷/ml密度接種角朊細胞繼續培養2天，將復合了細胞的膠原移至氣液面進行器官培養，培養1周即獲得組織工程皮膚。

1．3 燙傷模型制備：自行研制燙傷儀，通過控制系統可以調節金屬燙頭的溫度，計時器可以控制時間，根據調整燙頭和皮膚接觸的時間和溫度，可以制備出由淺至深的皮膚燙傷模型。術前12h禁飲食，豬麻醉后背部剃毛、清洗固定在實驗臺上。根據以有經驗，模擬深Ⅱ度燒傷模型，調節燙傷儀至：溫度100℃，時間20s。選直徑50mm的燙頭，當達到設定溫度時，放置在豬背部皮膚20s以獲得深達真皮深層的燒傷模型。實驗動物3只，共制備18個燒傷創面。

1．4 動物移植實驗：按實驗設計隨機分為3組：MSCs復合膠原移植組、單純膠原移植組和空白對照組，每組6個創面。在創面分別植入復合MSCs的組織工程皮膚、單純膠原。油紗布覆蓋，打包縫合所有創面，空白對照組不移植任何細胞和膠原，其他處理與實驗組相同。術后1周首次打開創面，常規換藥，連續觀察6周并進行組織學檢查。

1．5 術后觀察與分析：術后密切觀察創面情況，定期取創面皮膚標本做病理學檢察，觀察愈合時間，測量各組創面面積計算創面收縮率。公式：創面收縮率=(A₀-A_x)/A₀×100％，A₀是原始創面面積，A_x是術后第X天的面積。

2 結果

2．1 骨髓問充質干細胞：原代細胞接種后為圓形，首次換液后顯微鏡下可見稀疏分布的單個細胞貼壁生長，細胞為紡錘形、類圓形，7天后生長速度加快，呈典型的成纖維細胞外觀，約10天匯合成片即可傳代。

2．2 組織工程皮膚：光鏡下可見體外培養的組織工程皮膚，與正常的皮膚相似，具有雙層結構，其中表皮層較薄，真皮層較厚，表皮層和真皮層之間有基底膜，但組織工程皮膚中缺少毛囊和汗腺。

2．3 燙傷模型：在動物皮膚表面形成直徑50mm的圓形燙傷面，呈灰白色，邊緣是紅色的充血帶。組織學檢查顯示：表皮層破壞缺失，真皮層大部分凝固性壞死。

2．4 術后大體與組織學觀察：所有實驗動物到實驗結束均存活，飲食、排便正常，沒有術后感染、化膿、體液滲出等不良反應。在移植后1周，MSCs復合的組織工程皮膚與自體皮膚較好的融合，移植物顏色與自體皮膚顏色接近，隨著時間延長，移植物中毛細血管的數量逐漸增多，上皮角化不明顯；移植后2周，創面基本愈合，移植物顏色與自體皮膚顏色非常接近，瘢痕很小，上皮增厚，角化明顯，真皮層細胞生長良好，毛細血管大量增生。單純膠原組和空白對照組未完全愈合，移植區瘢痕形成，顏色較深。各組創面的愈合時間分別為(15.2±1.6)、(18.3±2.4)和(22.4±3.9)天，差異有顯著性意義。

2．5 創面收縮率：分別在移植后1周、2周、6周測量各組面積，計算創面收縮率。從第2周后，空白對照組收縮明顯大于其他兩組(P＜0.05)；在第6周，MSCs組和單純膠原組分別收縮到原始面積的61％和49％，而空白對照組收縮到原始面積的21％(P＜0.05)。

3 討論

組織工程皮膚是應用組織工程學的方法，將種子細胞與適當的支架相結合，在體外構建成具有一定功能的皮膚替代物。將其移植于創面，在支架材料逐漸降解吸收的過程中，細胞能正常生長、分化并形成有一定功能的皮膚組織。關于組織工程皮膚修復皮膚缺損的適應證，文獻報道現有的各種組織工程皮膚產品幾乎適用于各種原因引起的急、慢性皮膚缺損，包括：燒傷、潰瘍、外科創面及皮膚疾病等。與傳統的治療方法相比，使用組織工程皮膚有以下優點：在燒傷的治療中減少對供體組織的需求；減輕創面結痂和收縮現象；對大面積急性創面實現快速覆蓋；可作為傳遞外界生長因子的載體等。

在皮膚再生的研究領域中，實驗動物和人的皮膚是否相似是非常重要的。豬的皮膚在解剖結構和生理功能上與人皮膚很相似。Sullivan等證明在研究皮膚創傷愈合中，豬是理想的實驗動物模型。用本實驗室自行研制的燙傷儀，通過控制金屬燙頭和皮膚接觸的時間和溫度，可以建立由淺至深的皮膚燒傷模型。溫度100℃，時間20s時可以重復制備達到真皮層深部的燒傷模型。

骨髓問充質干細胞是一種具有多向分化潛能的細胞，可以分化為成纖維細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、肌細胞等。Badivas等證明骨髓細胞可使經久不愈的創面愈合和真皮重建。在皮膚缺損的模型中，骨髓間充質干細胞聯合堿性成纖維細胞生長因子可以加速皮膚的愈合。在深度燒傷病人的傷口表面使用自體骨髓間充質干細胞，能促進創面愈合和血管新生。在本研究中，含有骨髓間充質干細胞的組織工程皮膚相比對照組愈合時間快，創面收縮小，表皮層角質化和真皮層血管化的程度高。

骨髓問充質干細胞來源豐富，分離培養容易，增殖能力強，是組織工程領域中理想的種子細胞。本研究利用骨髓問充質干細胞構建的人工皮膚，成功修復了燒傷創面，收到了良好效果，為組織工程皮膚修復皮膚缺損提供了一種新的方法和思路。