Ａｄ－ＭＥＴＨｌ對培養的內皮細胞分泌活性的影響

[摘要]目的：研究基因重組血管抑制劑Ad－METHl(metalloprotease and thrombospondinl)對培養的內皮細胞分泌活性的影響，探討血管生成抑制防治增生性瘢痕的可能機制。方法：制備重組血管抑制劑Ad－METHl，轉染培養的人臍靜脈內皮細胞，通過放射免疫分析法及酶聯免疫分析法研究Ad－METHl對內皮細胞分泌內皮素－1(endothelin－1，ET－1)及堿性戍纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factot，bFGF)的影響。結果：基因轉染后24h內皮細胞ET－1、bFGF分泌受到明顯抑制。結論：Ad－METHl對內皮細胞ET－1、bFGF分泌活性有影響，此是其早期參與抑制增生性瘢痕形成的可能機制之一。

[關鍵詞]基因轉染；內皮細胞；內皮素－1；堿性成纖維細胞生長因子

[中圖分類號]R619.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)06－0740－03

近些年的研究顯示，血管生成與瘢痕增生有著密切的關系。我們的研究也顯示，基因重組血管抑制劑Ad－METHl可有效抑制兔耳增生性瘢痕的形成。內皮細胞作為主要的修復細胞在瘢痕組織血管生成及增生性瘢痕的形成中發揮著重要的作用，研究Ad－METHl對內皮細胞的生物學影響，對于揭示血管途徑抑制增生性瘢痕的可能機制有著重要意義。

1 材料和方法

1．1 材料：DMEM培養基、胰蛋白酶(Gibeo)，MTT(Amresco美國)，胎牛血清(華美生物工程公司)，125I－ET放射免疫分析藥盒(北京北免東雅生物技術研究所)，堿性成纖維細胞生長因子ELASA試劑盒(武漢博士德生物公司)；酶聯免疫檢測儀(DGS031，南京華東電子醫療公司)，Y計數儀(Capintce.inc美國)。

1．2 方法

1．2．1 重組血管抑制劑Ad－METHl的制備：利用基因重組技術，將高效血管抑制因子METHl克隆至腺病毒穿梭質粒pAdTrack－CMV(strategenge公司)中，用限制性內切酶Pmel(Takara公司)酶切使之線性化，在大腸桿菌BJ5183(strategenge公司)內與腺病毒骨架質粒pAdEasy－1(strategenge公司)同源重組，得到重組腺病毒載體pAdEasy－meth－1，用PacI(Takara公司)酶切線性化pAdEasy－meth－1，乙醇沉淀后，轉染293細胞(ATCC公司)，在細胞內包裝、重組，制備pAdEasy－methl重組腺病毒質粒。

1．2．2 內皮細胞培養：取人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC，由我校基礎部生理學教研室馬恒博士惠贈，為HUVEC細胞系)適量接種于DMEM培養基(10％胎牛血清，35.76mg/ml HEPES，青、鏈霉素各100U/m1)，在5％CO₂的37℃孵箱中貼壁生長至70％～80％融合狀態，加入0.25％胰蛋白酶消化傳代。

1．2．3 檢測Ad－METHl對內皮細胞分泌ET－1的影響：①取對數生長期的HUVEC，0.25％胰酶消化，調整細胞濃度為5×104個/ml，100μl接種于96孔培養板中(實驗組、對照組各10孔)，每孔5×10³個細胞。將培養板置于含5％CO₂、37℃、100％濕度的孵箱中培養，待細胞貼壁、伸展后實驗組加入Ad－METHl，對照組加入空載腺病毒各10μl。將培養板在CO₂孵箱中分別培養24h后吸取上清100μl待測。②加樣：用碘－內皮素(FT)放射免疫分析藥盒測實驗組與對照組內皮細胞上清液中ET－1的含量。按試劑盒說明中所列程序表加樣后充分混勻，室溫放置15min，任取兩管測量，作為總放射性強度T。3 500rpm(離心力1500g)離心20min，吸取上清液待測。③計數放射性活度：用16探頭Y計數儀分別對加樣處理后的標準管與樣品管的放射性活度進行計數，測量時間1min。標準曲線由美國Capintce.inc提供的軟件根據試劑盒中標準品濃度及其相對應的B/B₀值自動生成，其中B/B₀為縱坐標，標準品濃度為橫坐標。數據處理時，根據待測樣品B/B₀值，在標準曲線上求出待測樣品ET－1含量。

1．2．4 檢測Ad－METHl對內皮細胞分泌bFGF的影響：用堿性成纖維細胞生長因子ELISA試劑盒對培養上清中bFGF的濃度進行測定。實驗按照試劑盒說明書所列步驟進行，加入TMB終止液顯色后用酶標儀在450nm測定OD值，以TMB空白顯色孔為對照。以吸光值為縱坐標，抗原濃度為橫坐標，在坐標紙上繪制濃度一吸光值曲線。

2 結果

2．1 Ad－METHl對內皮細胞分泌ET－1的影響：根據待測樣品B/BO值，利用標準曲線得出實驗組與對照組待測樣品ET－1濃度，求均值。實驗組加入pAdEasy－methl后24h，培養上清液中ET－1濃度為(16.32±2.13)pg/m1(n=10)，對照組加入空載腺病毒后24h，培養上清液中ET－1濃度為(31.58±3.17)pg/ml(n=10)。采用SPSS10.0統計軟件包對實驗數據做t檢驗，兩者問有統計學差異(P＜0.05)，提示Ad－METHl對內皮細胞分泌ET－1的活性有明顯的抑制作用。

2．2 Ad－METHl對內皮細胞分泌bFGF的影響：根據不同濃度標準品所對應的吸光值，在坐標紙上繪制濃度一吸光值曲線，得出線性方程：Y＝－0.08734＋0.01632X。根據待測樣品的吸光值，利用此線性方程，求出對應bFGF濃度，求均值。實驗組加入pAdEasy－methl后24h，培養上清液中bFGF濃度為(46.30±2.34)pg/ml(n=10)，對照組加入空載腺病毒后24h，培養上清液中bFGF濃度為(117.87±4.12)pg/ml(n=10)。經Origin 7.0對數據進行統計分析，兩組間有統計學差異(P＜0.05)，提示Ad－METHl對內皮細胞分泌bFGF的活性有明顯的抑制作用。

3 討論

增生性瘢痕是整形外科的常見病、多發病，目前臨床缺乏有效的治療手段。眾多的研究顯示，血管生成與瘢痕增生有著密切的關系，通過血管生成抑制可有效抑制增生性瘢痕的形成。受此提示我們將經過基因重組的血管抑制劑Ad－METHl應用于增生性瘢痕的防治研究，發現在瘢痕形成早期局部應用Ad－METHl后，瘢痕組織中血管生成、成纖維細胞增殖及膠原的合成受到了明顯的抑制，提示Ad－METHl可能通過血管生成抑制途徑對增生性瘢痕產生了重要的影響。

內皮細胞作為主要的修復細胞在瘢痕組織血管生成及增生性瘢痕的形成中發揮著重要的作用，激活的內皮細胞分泌的多種細胞因子，如VEGF、bFGF、ET－1等，對增生性瘢痕的形成產生了重要的影響，而內皮細胞過度增殖及凋亡受損對于增生性瘢痕的形成也起到了重要作用。為了進一步揭示血管生成抑制對增生性瘢痕的作用機制，我們研究了Ad－METHl對內皮細胞分泌活性影響，

研究中，我們將Ad－METHl轉染培養的內皮細胞，24h后培養上清中的ET－1、bFGF的濃度量明顯降低，提示Ad－METHl抑制了內皮細胞對ET－1、bFGF的分泌。正常情況下，ET－1由內皮細胞分泌，真皮組織中有一定的表達，而ET－1在增生性瘢痕的微血管內皮細胞及成纖維細胞中呈高表達，有研究發現，ET－1是成纖維細胞的有絲分裂原，對瘢痕成纖維細胞DNA合成有明顯促進作用，可通過ET受體介導促進成纖維細胞對Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成，并可降低膠原酶活性、抑制膠原的降解。bFGF是創傷修復早期參與血管生成的主要的因子，也是成纖維細胞的有絲分裂原，可直接作用于組織修復細胞周期(內皮細胞、成纖維細胞)，使細胞G₁期比例下降，S期和G₂+M期比例增加，細胞周期轉換時間縮短，加速細胞的分裂與增殖，促進瘢痕組織成纖維細胞、內皮細胞的增殖及微血管的生成，研究顯示，bFGF在增生性瘢痕組織中表達增強，它對增生性瘢痕形成的起到了一定的促進作用。

我們的研究結果提示Ad－METHl可能通過對內皮細胞ET－1、bFGF分泌的影響而抑制了增生性瘢痕的形成，對內皮細胞ET－1、bFGF分泌活性的影響是Ad－METHl抑制增生性瘢痕形成的可能機制之一。