我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的培育及其特性

(安徽省廬江市泥河中學(xué) 231561)

中國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，作為重要的民用和戰(zhàn)略物資，棉花生產(chǎn)一直受到國(guó)家的高度重視。20世紀(jì)90年代，生物病蟲(chóng)害，尤其是棉鈴蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)啃蛀棉桿，蠶食棉葉，鉆蛀棉桃，對(duì)棉花危害極大。1991～1994年病蟲(chóng)害在北方棉區(qū)和長(zhǎng)江流域棉區(qū)每年造成高達(dá)60億元以上的經(jīng)濟(jì)損失。這突如其來(lái)的自然災(zāi)害，給棉花生產(chǎn)造成了巨大損失，棉農(nóng)談蟲(chóng)色變，植棉積極性空前低落。因此，具有本身能產(chǎn)生抗蟲(chóng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉很自然地引起了人們的興趣。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，通俗地說(shuō)，就是通過(guò)生物技術(shù)，把一種細(xì)菌的遺傳物質(zhì)(基因)轉(zhuǎn)移到棉花體內(nèi)，在其表達(dá)出相應(yīng)物質(zhì)后，讓棉鈴蟲(chóng)等害蟲(chóng)一吃就死，具有抗蟲(chóng)性狀的棉花。

1 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉常用的抗蟲(chóng)基因種類、特性

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉最常用的外源基因是Bt基因，即蘇云金桿菌毒蛋白基因。

蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，即Bt)是1902年日本人Ishiwata發(fā)現(xiàn)的，1909年Ber liner分離并命名的一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有專一的毒殺作用，是世界上目前應(yīng)用最廣、生產(chǎn)量最大的生物殺蟲(chóng)劑。蘇云金桿菌在形成芽孢時(shí)由基因控制產(chǎn)生一種分子量為130～160 kD的晶體蛋白質(zhì)或內(nèi)毒素，該蛋白質(zhì)被鱗翅目昆蟲(chóng)攝食后，在昆蟲(chóng)的中腸道內(nèi)經(jīng)蛋白酶水解，轉(zhuǎn)變成為65～70 kD帶有N－末端具有殺蟲(chóng)活性的毒性多肽分子，并與腸道中的氨肽酶N和鈣粘著蛋白結(jié)合后隨之插入到細(xì)胞膜上并形成穿孔，使細(xì)胞膜周質(zhì)和中膜腔之間的離子平衡被破壞，引起細(xì)胞腫脹甚至裂解，從而導(dǎo)致昆蟲(chóng)停止進(jìn)食而最終死亡。

目前全世界共獲得70多種Bt基因植物，其中有多種植物已在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用，2001年我國(guó)Bt棉面積大約在140-180萬(wàn)hm2，占全國(guó)棉花總面積的29．6％～38％。

2 抗蟲(chóng)基因?qū)敕椒?/p>

棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外源目的基因通過(guò)物理、化學(xué)或生物學(xué)方法導(dǎo)入棉花細(xì)胞并得到整合和表達(dá)的過(guò)程。自1987年美國(guó)A gracetus公司首次報(bào)道獲得轉(zhuǎn)基因棉花以來(lái)，棉花基因工程的研究進(jìn)展很快。我國(guó)用于抗蟲(chóng)棉研究和培育主要運(yùn)用了3種轉(zhuǎn)基因方法：

一種是花粉管通道法，一種是基因槍法，另外一種是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。

2．1花粉管通道法

花粉管通道法是繼周光宇等提出DNA片段雜交理論后，設(shè)計(jì)導(dǎo)入外源DNA的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。其原理為：授粉后外源DNA能沿著花粉管通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化到尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞中而自然發(fā)育成種子。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所(簡(jiǎn)稱中棉所)與江蘇農(nóng)科院合作，通過(guò)大量田間實(shí)踐，弄清了它的機(jī)理和規(guī)律，并大量應(yīng)用花粉管通道法成功地將抗蟲(chóng)基因?qū)朊藁āＴ摲ň哂胁灰蕾囍参锝M織培養(yǎng)和抗生素篩選，純合速度快、變異廣、操作方便、易于掌握等優(yōu)點(diǎn)。但是這種方法不足之處仍然存在，即成功率較低。

2．2基因槍法

基因槍法是使包裹質(zhì)粒DNA的金屬微粒(直徑1nm左右的金粉或鎢粉)通過(guò)加速器裝置獲得很高的加速度，從而穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，隨即進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，游離出自由的DNA分子并整合人受體細(xì)胞的基因組中，整合序列能正常遺傳。該法轉(zhuǎn)化受體范圍廣，使許多難于轉(zhuǎn)化的作物得到了轉(zhuǎn)化植株，但具有儀器價(jià)格昂貴、成本高、易得嵌合體等缺點(diǎn)。基因槍法原來(lái)是國(guó)外針對(duì)禾本科植物轉(zhuǎn)基因設(shè)計(jì)的，在棉花方面還沒(méi)有成功應(yīng)用的實(shí)例。中棉所通過(guò)自主研發(fā)和不斷創(chuàng)新，在完全無(wú)菌的環(huán)境中，可以對(duì)棉花莖尖進(jìn)行有效基因轉(zhuǎn)化。

2．3農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前應(yīng)用最為普遍的方法，現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化的植物實(shí)例中有80％以上是通過(guò)該法實(shí)現(xiàn)的。其導(dǎo)入原理為：

由于農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒(或Ri質(zhì)粒)中有一段DNA(稱T-DNA)可以從質(zhì)粒中分離出來(lái)，轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并整合到細(xì)胞核基因組，進(jìn)行復(fù)制、表達(dá)。利用此特性，將外源基因整合到T-DNA中，借T-DNA的轉(zhuǎn)移，達(dá)到將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的目的。

利用該法轉(zhuǎn)入基因受到宿主的限制，雙子葉植物及大多數(shù)裸子植物是農(nóng)桿菌良好的宿主，轉(zhuǎn)化效果好；而農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物轉(zhuǎn)化效果差。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化中，中棉所在營(yíng)養(yǎng)基配方等關(guān)鍵技術(shù)上也取得突破，使基因轉(zhuǎn)化周期由原來(lái)的12個(gè)月縮短到5～7個(gè)月，嫁接成活率達(dá)90％以上。

通過(guò)這3種辦法，中棉所已經(jīng)具備每年可獲得轉(zhuǎn)基因棉花材料1萬(wàn)株的能力，與國(guó)外跨國(guó)公司水平基本相當(dāng)。

3 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的抗蟲(chóng)特性

轉(zhuǎn)Bt基因棉的抗蟲(chóng)譜主要是鱗翅目害蟲(chóng)中的目標(biāo)害蟲(chóng)，在我國(guó)主要為棉鈴蟲(chóng)和紅鈴蟲(chóng)。轉(zhuǎn)Bt基因棉對(duì)上述目標(biāo)害蟲(chóng)抗性極好，對(duì)其致死率為90％～95％。據(jù)我國(guó)棉田主要鱗翅目害蟲(chóng)的抗性測(cè)試結(jié)果，對(duì)棉鈴蟲(chóng)抗性很強(qiáng)，初孵幼蟲(chóng)取食6d死亡率達(dá)95％～100％，對(duì)紅鈴蟲(chóng)也表現(xiàn)有較高抗性。

轉(zhuǎn)Bt基因棉對(duì)不同齡期害蟲(chóng)的抗性有明顯差異。對(duì)低齡幼蟲(chóng)特別是對(duì)初孵幼蟲(chóng)的抗性極強(qiáng)，隨著蟲(chóng)齡增大抗性降低。1～2齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)取食Bt棉嫩葉死亡率達(dá)95％～100％。

轉(zhuǎn)Bt基因棉殺蟲(chóng)毒素表達(dá)的時(shí)空特性。轉(zhuǎn)Bt基因棉的抗蟲(chóng)性有隨著棉株的生長(zhǎng)發(fā)育階段進(jìn)程而降低趨勢(shì)。測(cè)試表明：

營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段棉株毒性>營(yíng)養(yǎng)、生殖并存階段>生殖旺盛階段>成熟衰老階段；棉株子葉、真葉毒性>展開(kāi)頂葉>果枝邊葉、外圍小蕾>內(nèi)側(cè)大蕾>嫩鈴>硬鈴。

轉(zhuǎn)Bt基因棉在同一生育期不同空間部位組織的毒性表達(dá)也存在明顯差異，如花鈴期棉株的8種部位組織對(duì)棉鈴蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)測(cè)定的毒性順序從大到小依次為成熟葉、嫩葉、嫩尖、蕾、幼鈴、苞葉、花瓣、花蕊。這表明棉株?duì)I養(yǎng)組織的毒性比繁殖組織強(qiáng)，花蕊的抗性最弱，棉田中存活幼蟲(chóng)多在花蕊中查到。

4 轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的安全性問(wèn)題

4．1轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的環(huán)境安全性

4．1．1 對(duì)自然生物類群的影響

轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉，其目標(biāo)昆蟲(chóng)是棉鈴蟲(chóng)和紅鈴蟲(chóng)等植物害蟲(chóng)，如果大面積和長(zhǎng)期使用，昆蟲(chóng)有可能對(duì)抗蟲(chóng)蛋白的毒性產(chǎn)生適應(yīng)性，這不僅會(huì)使抗蟲(chóng)棉的應(yīng)用受到影響，而且會(huì)影響B(tài)t農(nóng)藥制劑的防蟲(chóng)效果。為了解決這個(gè)問(wèn)題，在抗蟲(chóng)棉推廣時(shí)一般要求種植一定比例的非抗蟲(chóng)棉，以延緩昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。但在我國(guó)，根據(jù)觀察研究表明，隨著抗蟲(chóng)棉采用率的提高，即使在山東與河北棉農(nóng)全部種植抗蟲(chóng)棉的情況下，連續(xù)7年的種植并未使棉鈴蟲(chóng)對(duì)抗蟲(chóng)棉的抗性有所增強(qiáng)。這主要因?yàn)樵谖覈?guó)的小農(nóng)經(jīng)濟(jì)模式下，棉農(nóng)經(jīng)常把棉花與其他作物間作和輪作，這會(huì)形成一種天然庇護(hù)所，防止目標(biāo)昆蟲(chóng)產(chǎn)生對(duì)抗蟲(chóng)棉的抗性。

除了目標(biāo)昆蟲(chóng)外，科學(xué)家還要考慮轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉對(duì)非靶昆蟲(chóng)的影響。有人用Bt毒蛋白飼喂棉田中6種非靶昆蟲(chóng)，當(dāng)殺蟲(chóng)蛋白濃度高于控制目標(biāo)昆蟲(chóng)濃度100倍時(shí)，對(duì)非靶昆蟲(chóng)均未出現(xiàn)可見(jiàn)的生長(zhǎng)抑制。因此，針對(duì)目前在抗蟲(chóng)棉區(qū)非靶性害蟲(chóng)(如盲椿螃)的危害有所上升的現(xiàn)象，人們提出了2種假設(shè)，一種觀點(diǎn)推測(cè)是氣候原因，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為抗蟲(chóng)棉種植后由于農(nóng)藥的大幅度減少，改善了這些非靶性害蟲(chóng)的生存條件，使之種群增加，通過(guò)積累對(duì)抗蟲(chóng)棉形成了危害。這

2 種觀點(diǎn)目前仍缺乏相應(yīng)的理論與實(shí)證結(jié)果證明。

另外，Bt蛋白對(duì)有益昆蟲(chóng)如蜜蜂、瓢蟲(chóng)等都無(wú)毒性，對(duì)棉田天敵昆蟲(chóng)無(wú)不良影響，棉田用藥量的降低，又有利于保護(hù)棉田天敵種群的繁衍增長(zhǎng)，發(fā)揮天敵對(duì)害蟲(chóng)的控制作用。

4．1．2基因漂流到近緣野生種的可能性

在自然生態(tài)條件下，有些栽培植物會(huì)和周圍生長(zhǎng)的近緣野生種發(fā)生天然雜交，從而將栽培植物中的基因轉(zhuǎn)入野生種中。若在這些地區(qū)種植轉(zhuǎn)基因植物，則轉(zhuǎn)入基因可以漂流到野生種中，并在野生近緣種中傳播，從而造成基因污染。

但如果在種植轉(zhuǎn)基因棉花的周邊地區(qū)，沒(méi)有近緣野生種存在則不可能發(fā)生基因轉(zhuǎn)移。當(dāng)然若存在近緣野生種，基因可從抗蟲(chóng)棉轉(zhuǎn)移到野生種中，但因?yàn)锽t蛋白抗蟲(chóng)譜的特異性，增加野生種的生存競(jìng)爭(zhēng)力的可能性不大。

4．2轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性

由于棉鈴蟲(chóng)的腸道是堿性環(huán)境，會(huì)使食入的Bt蛋白，在2個(gè)特定的位點(diǎn)被酶切開(kāi)，從而產(chǎn)生毒性，毒死棉鈴蟲(chóng)等害蟲(chóng)。而人和哺乳動(dòng)物的胃液呈強(qiáng)酸性，即使攝入Bt蛋白，在胃部酸性條件下，蛋白質(zhì)的任何部分都可以被酶切開(kāi)，從而轉(zhuǎn)化為有益的氨基酸被吸收利用，而不存在任何毒性。

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