TET1基因敲除的宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲能力觀察

沈鳳，丁妍，譚玉潔, 3

(1貴州醫科大學，貴陽 550000；2 湖北醫藥學院附屬太和醫院；3貴州醫科大學附屬醫院)

TET1基因敲除的宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲能力觀察

沈鳳1，丁妍2，譚玉潔1, 3

(1貴州醫科大學，貴陽 550000；2 湖北醫藥學院附屬太和醫院；3貴州醫科大學附屬醫院)

目的 觀察TET1基因敲除的宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲能力。方法 采用CRISPR/Cas9技術構建TET1敲除的Hela細胞株(觀察組)，同時選擇野生Hela細胞作為對照組。采用實時無標記動態細胞分析技術觀察兩組細胞增殖能力，計算兩組90 h時的細胞指數(CI)值；采用Transwell實驗觀察兩組細胞的侵襲能力。結果 觀察組、對照組CI值分別為1.04±0.86、1.57±1.01，兩組相比P<0.05。觀察組、對照組24 h穿膜細胞數分別為(158±6)、(109±4)個，48 h穿膜細胞數分別為(206±12)、(142±7)個，兩組相比P均<0.05。結論 TET1基因敲除的宮頸癌Hela細胞增殖能力、侵襲能力增強。

宮頸癌；Hela細胞；TET1基因；CRISPR/Cas9技術；細胞增殖；細胞侵襲

DNA胞嘧啶甲基化是一個可逆性的調節基因表達的表觀遺傳學標志物，參與了細胞生理的關鍵過程，包括X染色體失活、印記和轉錄特異基因等[1]。TET蛋白家族在DNA胞嘧啶的去甲基化、胚胎發育和基因重新編碼等過程存在重要作用，且與腫瘤的發生有關[2,3]，成員有TET1、TET2和TET3。TET1發現最早，是一種羥基化酶，能啟動DNA去甲基化程序，調控胚胎干細胞的發育，并與腫瘤、神經系統、血液系統等疾病發病密切相關[4]。TET1在宮頸癌中的研究較少，因此本研究利用CRISPR/Cas9技術[5,6]構建了穩定敲除TET1的宮頸癌Hela細胞，并觀察其細胞增殖、侵襲能力變化。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器及試劑 Hela細胞和DH5ɑ感受態細胞由本實驗室保存，pGK1.2質粒購自Invitrogen公司?；蚪M提取試劑盒、質粒小提試劑盒、膠純化/回收試劑盒、Taq PCR Mastermix、Matrige膠購自TIANGEN(天根)公司，轉染試劑Lipofectamine3000 Reagent購自Invitrogen公司，T4DNA連接酶和T7E1酶購自NEB(北京)有限公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，DMEM培養基購自美國Gibco公司，DNA Marker購自碧云天公司，瓊脂糖購自上海博亞公司。

1.2 TET1基因敲除的宮頸癌Hela細胞獲取方法

1.2.1 oligo DNA設計和合成 通過CRISPR Design在線工具在靶標DNA區域中設計oligo DNA序列，為使pGK載體形成黏性末端，引物合成需在靶序列頭部添加額外的堿基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC。分別設計3組oligo DNA，在位點上下游各設計1條引物，用于后續檢測。TET1(Cas9)-1 F:5′-CACCGAGGCTTCTGACTGGCACGGG-3′,R：5′-AAACCCCGTGCCAGTCAGAAGCCTC-3′;TET1(Cas9)-2 F:5′-CACCGATCTGGAAGGCCTTGCATGG-3′,R：5′-AAACCCATGCAAGGCCTTCCAGATC-3′;TET1(Cas9)-3 F:5′-CACCGCCTTGGTTGTCTTTCGTAGT-3′,R：5′-AAACACTACGAAAGACAACCAAGGC-3′；T7E1 F:5′-GACCAAAACCTTGTGTGA-3′,R：5′-TGCTTCGTAGCGCCATTGTA-3′。

1.2.2 載體構建 將上述合成的2條單鏈oligo DNA退火形成雙鏈的dsDNA，再將dsDNA連接到pGK1.2質粒，最后篩選陽性質粒。dsDNA形成體系：37 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，降溫至25 ℃。連接反應體系：pGK1.2質粒150 ng，gRNA寡核苷酸雙鏈1 μL，10×T4DNA連接酶緩沖液1 μL，T4連接酶1 μL，補足雙蒸水至10 μL，充分混勻后在PCR儀上4 ℃連接過夜。將連接過夜的產物轉化到DH5ɑ感受態細胞中，然后挑取單克隆細菌到含有卡那霉素(pGK1.2為Kan抗性)的培養基中培養2 h，選擇能在含有卡那霉素的培養基中正常生長帶目的基因的陽性質粒。進行菌落PCR和2%瓊脂糖凝膠電泳分析發現，只有TET1(cas9)-2在100 bp處有條帶，將其菌液送到生工測序，并將測序正確的質粒進行擴增，用于下一步細胞轉染實驗。

1.2.3 細胞轉染及基因組DNA提取 將上述Case9質粒轉染到Hela細胞中，成功后提取基因組DNA進行后續PCR及T7E1檢測。Hela細胞采用DMEM培養基和10%胎牛血清在37 ℃含5% CO2的恒溫培養箱中培養。當6孔板中的Hela細胞密度達到60%左右時，使用脂質體介導的轉染試劑Lipofectamine3000 Reagent將Case9質粒轉染到Hela細胞中，質粒終濃度為1.5 μg/L，同時采用空白質粒作為陰性對照。轉染操作均按試劑說明書進行。轉染成功的Hela細胞會發出綠色熒光，可采用熒光顯微鏡觀察。將轉染質粒后的細胞培養72 h，取一部分細胞進行傳代以及凍存保種，另一部分細胞消化后用PBS洗3次，按照試劑盒說明書的操作步驟提取基因組DNA。

1.2.4 TET1-gRNA的敲除效率檢測 采用PCR、T7E1酶切法。PCR條件如下：Taq PCR Mastermix 5 μL，TET1(T7E1)-(F+R)0.5 μL，基因組DNA 2 μL，補水至10 μL。程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。先取上述反應后的產物5 μL，進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測到目的條帶后進行T7E1檢測。T7E1分析步驟如下：PCR產物5 μL，10×T7E1 Buffer 1 μL，補水至10 μL；使用PCR儀進行加熱變性，退火處理95 ℃ 5 min，自然冷卻至室溫；將上述反應體系分別加入0.5 μL T7E1酶，37 ℃反應30 min后用2%瓊脂糖凝膠進行分析。選取兩孔轉染TET1-gRNA質粒成功的Hela細胞(觀察組)及野生型Hela細胞(對照組)，正常培養72 h后提取基因組DNA，T7E1酶切驗證結果顯示觀察組細胞在約300、100 kb處均有敲除后的特異性條帶，采用凝膠定量軟件計算切割效率[7]，切割效率分別為54%和30%，對照組細胞只有500 kb條帶。

1.2.5 細胞TET1蛋白檢測 采用Western blotting法。將上述兩組Hela細胞接種至96孔板培養，每孔單細胞接種，等細胞長到一定數量后擴增至24孔板，再等細胞長到一定數量后，擴增至12孔板，此時將細胞部分保種凍存，部分提取細胞蛋白，同時提取基因組DNA，PCR擴增目的片段，送生工測序。Western blotting法檢測結果發現，對照組細胞正常表達TET1蛋白，觀察組蛋白表達明顯下調或缺失。

1.3 細胞增殖能力觀察 采用實時無標記動態細胞分析技術。常規培養觀察組、對照組Hela細胞，待其達到對數生長期時分別對兩組細胞進行消化計數。采用25%的胰酶消化細胞，待細胞變圓變透亮時，棄掉胰酶加入含10% FBS的DMEM培養基終止消化，吹打成細胞懸液后計數。每孔接種3 000個細胞，接種于無菌的E-plate細胞板，每孔設8個復孔。按照儀器使用說明書，在xCELLigence RTCA S16系統上培養90 h，自動實時記錄細胞增殖情況并繪制曲線。計算兩組90 h的細胞指數(CI)，CI值與細胞數量成正比，細胞量越多，CI值越高，細胞增殖能力越強[8]。

1.4 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。在每個Transwell小室加入稀釋后的Matrigel膠200 μL，置于培養箱中4 h后使用。在Transwell上室中加入200 μL無血清的DMEM，下室中加入500 μL含10% FBS的新鮮培養液DMEM。將觀察組、對照組Hela細胞分別計數3 000個細胞加入到上室中培養。培養24、48 h后結晶紫染色，在顯微鏡下計算穿過聚碳酸酯膜的細胞數量，每張膜隨機計數5個視野。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 觀察組、對照組CI值分別為1.04±0.86、1.57±1.01，兩組相比P<0.05。

2.2 兩組細胞侵襲能力比較 觀察組、對照組24 h穿膜細胞數分別為(158±6)、(109±4)個，48 h穿膜細胞數分別為(206±12)、(142±7)個，兩組相比P均<0.05。

3 討論

宮頸癌的發病與HPV感染有關，但HPV感染并不是導致宮頸癌發生發展的惟一因素，DNA甲基化也參與宮頸癌的發生及演進[9]。TET1是體內一種高效催化DNA胞嘧啶的加氧酶，具有明顯的去甲基化作用。TET1在DNA去甲基過程、干細胞編程和抑制腫瘤細胞增殖等方面起關鍵作用，它發揮作用的主要方式是通過將5-甲基胞嘧啶轉化為5-羥甲基胞嘧啶，并進一步轉化為5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶達到DNA去甲基化目的。這幾種物質之間存在著甲基化和去甲基化的動態平衡，如果TET1的表達缺失，這種平衡將被打破，就可能引起癌癥的發生或發展。研究[10]發現，TET1在多種腫瘤如肝細胞癌、肺鱗狀細胞癌、前列腺癌、膀胱癌中呈低表達。且TET1的減少或者缺失和癌癥的發生和進展關系密切，如乳腺癌、腎癌、結直腸癌等[11]。

本研究細胞增殖試驗結果顯示，觀察組CI比對照組高，表明觀察組增殖能力增強。Transwell實驗結果顯示，觀察組24、48 h的穿膜細胞數均比對照組多，表明觀察組的侵襲能力增強?？梢?，降低TET1基因的表達水平，Hela細胞增殖、侵襲能力增強。Cimmino等[12]研究發現，TET1在造血系統中調節多種生理或病理過程，可能起抑癌基因作用。研究[13,14]發現，結腸癌、前列腺癌與乳腺癌組織中TET1基因表達下調。ONeri等[15]研究發現，TET1缺失促進了結直腸腫瘤細胞的侵襲和生長，還誘導了腫瘤細胞的轉移；TET1過表達降低了腫瘤細胞的侵襲并抑制了其他部位轉移瘤的形成。結合本研究結果推斷TET1低表達可促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲。

可見，TET1表達的下調不僅與宮頸癌的侵襲、轉移有關，而且可能是活化基因、誘導細胞增殖、導致腫瘤發生的重要因素之一。對TET1的深入研究將有助于弄清腫瘤的發生發展機制，對腫瘤的早期診斷、預后判斷及治療有重要幫助。

[1] Williams K, Christensen J, Helin K． DNA methylation: TET proteins-guardians of CpG islands[J]. J EMBO Rep, 2011,13(1):28-35.

[2] He YF, Li BZ, Li Z, et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA[J]. Science, 2011,333(6047):1303-1307.

[3] Schomacher L. Mammalian DNA demethylation: multiple faces and upstream regulation[J]． J Epigenetics, 2013,8(7): 679-684.

[4] Ono R, Taki T, Taketani T, et al. LCX, leukemia-associated protein with a CXXC domain, is fused to MLL in acute myeloid leukemia with trilineage dysplasia having t(10;11)(q22;q23)[J]. Cancer Res, 2002,62(14):4075-4080.

[5] Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science, 2014,346(6213):1258-1296.

[6] Yang H, Wang HY, Shivalila CS, et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell, 2013,154(6):1370-1379.

[7] Fedorov Y, Anderson EM, Birmingham A， et al. Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype[J]. RNA, 2006,12(7):1188-1196.

[8] 孔凡虹，董成亞，何露，等．實時無標記細胞檢測技術在細胞培養質量控制中的應用[J]．標記免疫分析與臨床,2016,23(2):202-205．

[9] Mohr F, Dohner K, Buske C, et al. TET genes: new players in DNA demethylation and important determinants for stemness[J]. Exp Hematol, 2011,39(3):272-281.

[10] Tian Y, Pan F, Sun X, et al. Association of TET1 expression with colorectal cancer progression[J]. Scand J Gastroenterol, 2017,52(3):312-320.

[11] Vincent JJ, Huang Y, Chen PY, et al. Stage-Specific Roles for Tet1 and Tet2 in DNA Demethylation in Primordial Germ Cells[J]. Cell Stem Cell, 2013,12(4):470-478.

[12] Cimmino L, Dawlaty MM, Ndiaye-Lobry D, et al. TET1 is a tumor suppressor of hematopoietic malignancy[J]. Nat Immunol, 2015,16(6):653-662.

[13] Kudo Y, Tateishi K, Yamamoto K, et al. Loss of 5-hydroxymethylcytosine is accompanied with malignant cellular transformation[J]. Cancer Sci， 2012,103(4):670-676.

[14] Hsu CH, Peng KL, Kang ML, et al. TET1 suppresses cancer invasion by activating the tissue inhibitors of metalloproteinases[J]. Cell Rep, 2012,2(3):568-579.

[15] ONeri F, Dettori D, Incarnato D, et al. TET1 is a tumour suppressor that inhibits colon cancer growth by derepressing inhibitors of the WNT pathway[J]. Oncogene, 2015,34(32):4168-4176.

Proliferation and invasion abilities of TET1 gene knock-out Hela cervical cancer cells

SHENFeng1,DINGYan,TANYujie

(1GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,China)

Objective To observe the proliferation and invasion abilities of ten-eleven translocation 1 (TET1) gene knock-out Hela cervical cancer cells. Methods We constructed the TET1 knock-out Hela cells by CRISPR/Cas9 technology, which were defined as the observation group. At the same time, we defined wild Hela cells as the control group. We observed the proliferation ability of Hela cells in the observation and control group by the real-time cellular analysis (RTCA), and calculated the cell index (CI) values in each group at 90 h. We observed the invasion ability of Hela cells in each group by Transwell assay. Results The CI value of the observation group was 1.04±0.86, which was higher than that of the control group (1.47±1.01) (P<0.05). At 24 h, the transmembrane cells in the observation group and the control group were 158±6 and 109±4, respectively; at 48 h, the of transmembrane cells in each group were 206±12 and 142±7, respectively; significant difference was found between these two groups (P<0.05). Conclusion The proliferation and invasion abilities of TET1 gene knock-out Hela cells become stronger.

cervical carcinoma; Hela cells; TET1 gene; CRISPR/Cas9 technique; cell proliferation; cell invasion

國家自然科學基金資助項目(81602297)；貴州省科技計劃項目(黔科合基礎2016-1121)。

沈鳳(1986-)，女，碩士，初級檢驗師，主要從事宮頸癌及宮頸相關疾病的研究。E-mail: 449241354@qq.com

譚玉潔(1969-)，女，碩士，主任技師，主要從事宮頸癌及宮頸相關疾病的研究。E-mail: 943356809@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.22.007

R737.33

A

1002-266X(2017)22-0023-03

2016-12-05)