CaMKⅡ在高脂血癥大鼠陰莖海綿體中的表達(dá)及其對RAF/MEK含量的影響①

孫盛洋，郭玉剛

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江佳木斯154003)

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CaMKⅡ在高脂血癥大鼠陰莖海綿體中的表達(dá)及其對RAF/MEK含量的影響①

孫盛洋，郭玉剛

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的:研究高脂血癥對大鼠陰莖海綿體中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)表達(dá)的影響和對RAF激酶/分裂原活化抑制劑(RAF/MEK)含量的影響。方法:32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，在實(shí)驗(yàn)第10天和第20天，隨機(jī)各選兩中組一半大鼠觀察勃起情況;采用免疫組化及圖像分析的實(shí)驗(yàn)方法對其海綿體所含CaMKⅡ研究觀察并測所含計量，同時測量P－RAF的表達(dá)情況;以分光光度的實(shí)驗(yàn)方法對海綿體勻漿中一氧化氮合酶(NOS)的活性濃度進(jìn)行量的測量。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)第10天，實(shí)驗(yàn)組CaMKⅡ表達(dá)較對照組低，NOS活性及大鼠陰莖勃起次數(shù)均降低(P＜0.05) ;實(shí)驗(yàn)第20天，實(shí)驗(yàn)組及對照組的CaMKⅡ均降低，P－RAF的表達(dá)呈減少趨勢(P＜0.05)，與第10天相比明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:高脂血癥大鼠陰莖海綿體CaMKⅡ、P－RAF表達(dá)下降，NOS活性降低，高脂血癥是勃起功能障礙誘因。

關(guān)鍵詞:高脂血癥; CaMKⅡ; P－RAF;一氧化氮合酶

男性疾病中勃起障礙(ED)較為常見，越來越多的學(xué)者研究此疾病的流行及其發(fā)病原理。許多實(shí)驗(yàn)資料及臨床記錄表明高脂血癥引起陰莖勃起障礙，主要是由晚期動脈堵塞所致對內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌的作用及對陰莖外周神經(jīng)的控制受到破壞。目前研究表明，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)通過磷酸化而對內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性進(jìn)行抑制從而使海綿體中平滑肌興奮性降低最終致陰莖勃起障礙，但目前尚未找到其磷酸化的作用點(diǎn)［1］。ERK1/2信號與有關(guān)信號共同在在大鼠海綿體平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)作用調(diào)節(jié)陰莖勃起。本實(shí)驗(yàn)研究對Raf/MEK/ERK1/2信號通路于大鼠陰莖的勃起中起到的作用及其各信號之間的聯(lián)系做了記錄，以求探清對陰莖勃起的作用分子［2］。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物挑選種系相同，年齡皆為3個月的雄性大鼠Wistar共計32只，隨機(jī)分配分為兩組，一組為實(shí)驗(yàn)組(高脂血癥大鼠)，一組為對照組(正常大鼠)，各為16只。

1.2試驗(yàn)方法

通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行血液檢查、病理檢查。對陰莖勃起的功能進(jìn)行測定，收集標(biāo)本和制備陰莖海綿體勻漿，制作切片后觀察組織形態(tài)，用染色法觀察陰莖組織中的CaMKⅡ，并計算灰度值。采用考馬斯亮蘭法檢測組織蛋白的濃度，根據(jù)NOS試劑盒的說明書進(jìn)行準(zhǔn)確操作測定NOS的活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)兩兩比較用t校驗(yàn)，多組比較運(yùn)用方差分析，直線相關(guān)回歸處理相關(guān)統(tǒng)計，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，當(dāng)P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1阿樸嗎啡臨床效果

頸部給予注射APO后，觀察大鼠陰莖勃起功能表現(xiàn)，高脂組10d陰莖勃起次數(shù)(2.05±0.68)與對照組10d (3.18±1.34 )相比，顯著減少(P＜0.05) ;高脂組20d(1.14±0.29)陰莖勃起次數(shù)與對照組20d (3.21±1.30)相比，顯著減少(P＜0.05) ;高脂組20d(1.14±0.29)與高脂組10d(2.05±0.68)相比，陰莖勃起次數(shù)明顯降低(P＜0.05)。

2.2 eNOS和NOS蛋白表達(dá)

在陰莖海綿體與竇壯隙內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，主要表達(dá)eNOS蛋白，黃棕色顆粒表示其為陽性，呈局部性、散在性分布。而在陰莖海綿體平滑肌組織細(xì)胞及其間質(zhì)中，主要表達(dá)eNOS蛋白，棕褐色為陽性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，表現(xiàn)為彌漫性。各組的eNOS陽性反應(yīng)，見表1。

1eNOS(±s)

1eNOS(±s)

注:*與對照組比較P＜0.05;△與高脂組10d比較P＜0.05。

組別　eNOS蛋白吸光度值A(chǔ)實(shí)驗(yàn)組10d觀察組　0.0816±0.0028*20d觀察組　0.0651±0.0062＊△對照組10d觀察組　0.1143±0.0013 20d觀察組0.1063±0.0024

2.3大鼠陰莖組織內(nèi)CaMKⅡ的檢測CaMKⅡ免疫

組織化學(xué)染色

CaMKⅡ陽性著色均呈棕黃色顆粒，主要定位于海綿竇和血管內(nèi)皮細(xì)胞。圖像分析結(jié)果:高脂組與對照組相比，大鼠陰莖海綿體組織細(xì)胞胞漿內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值明顯升高(P＜0.05) ;高脂組兩個階段相比，高脂組20d與高脂組10d比較，大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值有顯著性差異(P＜0.05)，說明隨病程延長，CaMKⅡ的表達(dá)逐漸增加。

表2　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中CaMKⅡ的平均灰度值(±s)

表2　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中CaMKⅡ的平均灰度值(±s)

注:#與對照組比較P＜0.05;▲與高脂組10d比較P＜0.05。

組別　　平均灰度值對照組10d　102.35±3.17對照組　20d　103.10±2.85高脂組　10d　121.28±3.76#高脂組　20d　140.56±3.95▲

2.4 P－RAF的測定

高脂組大鼠陰莖海綿體組織中P－RAF含量較對照組明顯增加(P＜0.05) ;高脂組20d大鼠陰莖海綿體組織中P－RAF含量較高脂組10d增加(P＜0.05)，說明隨病程延長，P－RAF含量逐漸增加。

表3　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中P－RAF含量(±s)

表3　高脂血癥組和對照組大鼠陰莖組織中P－RAF含量(±s)

注:⊿與對照組比較P＜0.05;▲與高脂組10d比較P＜0.05。

組別　P－RAF 濃度對照組10d　5.84±0.41對照組　20d　3.55±0.37高脂組　10d　7.08±1.27⊿高脂組　20d　7.42±1.28▲

3　討論

本次研究通過建立患有高脂血癥大鼠的動物模型，推測高脂血癥對于大鼠陰莖內(nèi)的eNOS的作用效果，研究疾病發(fā)生的病理機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組的陰莖勃起頻率明顯降低，eNOS的活性也受到明顯抑制，實(shí)驗(yàn)組與對照組存在明顯差異，證明高脂血癥對大鼠陰莖內(nèi)的eNOS的活性具有抑制作用，繼而造成陰莖勃起功能障礙。此外，實(shí)驗(yàn)組對于六周后與12周后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)eNOS的活性均受到明顯抑制，推測此結(jié)論為陰莖勃起功能障礙的病理機(jī)制［3］。CaMKⅡ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果: CaMKⅡ陽性著色均呈棕黃色顆粒，主要定位于海綿竇和血管內(nèi)皮細(xì)胞［4］。圖像分析結(jié)果:高脂組與對照組相比，大鼠陰莖海綿體組織細(xì)胞胞漿內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值明顯升高(P＜0.05) ;高脂組兩個階段相比，高脂組20d與高脂組10d比較，大鼠陰莖海綿體組織內(nèi)CaMKⅡ的平均灰度值有顯著性差異(P＜0.05)，說明隨病程延長，CaMKⅡ的表達(dá)逐漸增加。高脂組大鼠陰莖海綿體組織中PRAF含量較對照組明顯增加(P＜0.05) ;高脂組20d大鼠陰莖海綿體組織中P－RAF含量較高脂組10d增加(P＜0.05)，說明隨病程延長，P－RAF含量逐漸增加。CaMKⅡ表達(dá)增加，P－RAF含量增加，影響eNOS在大鼠陰莖海綿體中的含量，這可能是高脂血癥引起ED的發(fā)病機(jī)制之一［5］。根據(jù)上述報告顯示，通過喂養(yǎng)法建立動物模型并進(jìn)行觀察研究，結(jié)果表明陰莖勃起與高脂血癥具有密切關(guān)系［6］。由于國人在飲食以及生活環(huán)境受到很多負(fù)面影響，促使高脂血癥及其并發(fā)癥的發(fā)病率逐年升高［7］。本次試驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)高脂血癥對于陰莖勃起功能的影響，高脂血癥大鼠陰莖海綿體CaMKⅡ、P－RAF表達(dá)下降，NOS活性降低。高脂血癥是勃起功能障礙的誘發(fā)因素的一種。

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［5］郝鵬，馬飛虹，羅振國，等.高半胱氨酸血癥大鼠陰莖海綿體內(nèi)Hcy及MTHFR的相關(guān)性研究［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014，37 (1) : 38－42

［6］孫文娟，劉潔，楊世杰，等.不同產(chǎn)地長梗燕白提取物對高脂血癥大鼠脂代謝的影響及其抗氧化作用［J］.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1999，25(3) : 259－261

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The expression of hyperlipidemia CaMKⅡin rat corpus cavernosum and its impact on RAF/MEK content

SUN Sheng－yang，GUO Yu－gang
(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Abstract:Objective: To study the effects of CaMKⅡin rat corpus expression and influence of hyperlipidemia on the RAF / MEK＇s.Methods: 32 male wistar rats were randomly divided into experimental and control groups in the experiment 10 days and 20 days.Rats were randomly selected in each group，and they were observed erections half; measuring the expression of CaMKⅡ，P－RAF＇s; nitric oxide synthase (NOS) activity concentrations.Results: In the first 10 days，the experimental group CaMKⅡexpression compared with the control group，NOS activity and penile erections were lower (P＜0.05) ; experiment first 20 days，the experimental group and the control group CaMKⅡdecreased，P－RAF expression tended to decrease (P＜0.05)，which was significantly lower compared with the first 10 days (P＜0.05).Conclusion: The expression of corpus cavernosum CaMKⅡ，P－RAF for hyperlipidemia rat decreased，and NOS activity is low.Hyperlipidemia is the incentive of erectile dysfunction.

Key words:hyperlipidemia; CaMK ; P－RAF; nirtic oxide synthase

(收稿日期:2015－12－07)

通訊作者:郭玉剛(1967～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E－mail: 15145487111@163.com。

作者簡介:①孫盛洋(1982～)男，黑龍江富錦人，碩士，住院醫(yī)師。

中圖分類號:R691.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0061－02