百合黃瓜花葉病毒及其檢測

劉文洪　洪　健　陳集雙　葉美琴　黃東峰

摘要應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測了浙江麗水和杭州的東方百合、亞洲百合等栽培品種上黃瓜花葉病毒(CMV)，64個田間樣品中有26個帶毒，檢出率為40．6％~dsRNA檢測結果與已知CMV—FQS株系的電泳條帶相同，但百合組織中CMVdsRNA含量較低；電鏡觀察，受CMV侵染的樣品中大多含有線狀病毒，復合侵染率為35．9％；寄主反應測定顯示從百合植株上獲得的CMV株系均不能通過汁液摩擦接種侵染昆諾藜、莧色蔡、普通煙、心葉煙等6科10種指示植物。

關鍵詞植物病理學；黃瓜花葉病毒；百合；EIJSA；dsRNA檢測

中圖分類號S 436．8

百合是一種重要的經濟作物，鱗莖宜糧宜菜，還可入藥，花供觀賞，在我國各地已有規模化種植，但病毒病已成為嚴重影響其產量和品質的主要因素。研究侵染百合的病毒種類及診斷檢測技術，對控制百合病毒的發生危害具有重要意義。目前國外報道百合病毒病原有14種之多，但主要危害的有黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic uirus，CMV)、百合無癥病毒(Lis2anptomless virus，LSV)、百合斑駁病毒(lily mottle virus,LMoV)、百合叢簇病等4種。在我國，尚未見有關侵染百合的CMV研究報道。本文經過一年多調查，發現浙江麗水和杭州的東方百合、亞洲百合等栽培品種普遍受到病毒侵染，由于百合種球來源不同，帶毒情況復雜，田間發病癥狀呈多樣化，復合侵染現象十分普遍。通過常規生物接種進行寄主反應測定，結合酶聯免疫吸附(EIJSA)技術、&RNA檢測技術、電鏡負染色觀察等，對侵染兩地百合的CMV進行了檢測診斷，并初步分析了田間樣品的復合感染情況，為進一步應用分子生物學手段進行百合病毒種類的分子鑒定奠定了基礎。

1材料和方法

1．1病毒材料的采集與保存

自然發病或無明顯癥狀的東方百合[LiliumCVS．(Oriental Hybrids)]、亞洲百合[LiliumCVS．(AsiaticHybrids)]、百合鐵亞雜種[Lilium cvs(L/A)]等各品種材料于2002年4一12月分別采自浙江省麗水市百合種植基地和杭州市郊等地，按照采集時間、百合品種等內容進行田間記錄和編號，1～45號為東方百合，46～57號為亞洲百合，58—63號為百合鐵亞雜種，64號甜百合為食用百合。部分樣品將整株病株從田間移植到溫室進行觀察研究。

1．2ELlSA檢測

參照馬德芳的方法用抗體夾心ELISA法檢測田間百合樣品是否被黃瓜花葉病毒(CMV)侵染，CMV酶標抗體購自北京雙贏世元生物技術公司。

1．3dsRNA檢測

對經過CMV抗體ELISA檢測呈陽性的一個東方百合樣品(2號)提取dsRNA，進行l％瓊脂糖凝膠電泳，以接種侵染番茄的CMV分離物FQS的心葉煙作為對照。

1．4感病組織汁液中線狀病毒電鏡檢測

將經過ELISA檢測的田間百合葉片組織在研缽中充分研磨至勻漿，用銅網蘸取組織粗汁液，直接用2％磷鎢酸(PTA)負染色，在JEM—1200EX型透射電鏡下觀察線狀病毒粒子的有無。

1．5寄主反應測定

取經過ELISA和dsRNA檢測證實被CMV侵染的東方百合樣品(2號)作為毒源，用常規汁液摩擦法接種于茄科(Solanaceae)、葫蘆科(Cucuribita—ceae)、藜科(Chenopodiaceae)、莧科(Amaranthace—ae)、十字花科(Cruciferae)、豆科(1．eguminosae)等6科10種供試植物，以CMV-FQS株系作為對照同時接種上述10種植物，第l批接種試驗重復3次，第2批接種試驗重復2次，觀察并記錄癥狀發生情況，不能顯示癥狀的植物用枯斑寄主檢測其隱癥帶毒情況。

2結果

2．1百合病毒病的田間癥狀

受病毒侵染的百合田間癥狀多樣，主要體現在葉、花、莖上(封面彩圖，田間主要癥狀有斑駁、條斑、花葉、黃化壞死、花碎色、畸形、黃扁叢簇。)病害最為嚴重的是東方百合各品種。

2．2CMV抗體ELISA檢測結果

對64個田間樣品用CMV抗體進行E1．ISA檢測，結果顯示：64個樣品中有26個樣品呈陽性，CMV的檢出率為40．6％(表1)。試驗數據顯示，來自百合上CMV的ELISA陽性反應較其他來源的CMV弱，OD值顯示相對較低，表明百合CMV與其他來源的CMV在血清學上有一定的差異。

2．3dsRNA檢測結果

通過對E1．ISA檢測呈陽性反應的2號樣品提取dsRNA，l％瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示有大小為3 300nt、3 000nt、2 200nt左右的3條電泳條帶，與作為對照的已知CMV(FQS)感染心葉煙上得到的ds RNA條帶相同(圖1)，表明2號百合樣品中含有CMV，這與ELISA檢測結果一致。

2．4百合樣品線狀病毒電鏡檢測結果

對64個田間百合樣品進行電鏡負染色觀察發現有48個樣品存在著線狀病毒粒子，其中有23個樣品同時檢測到CMV(表1)，表明為線狀病毒與CMV復合侵染，復合侵染率達35．9％。

2．5寄主反應測定結果

寄主接種試驗結果顯示，從百合病株上獲得的CMV不能通過汁液摩擦接種侵染昆諾藜、莧色藜、普通煙、心葉煙等指示植物，而作為對照毒株CMV(FQ5)則在這些指示植物上表現出典型的侵染癥狀(表2)，這表明侵染百合的CMV可能對百合植物產生了寄主適應性變異，喪失了通過汁液摩擦接種傳播的特性。同時也表明復合侵染的線狀病毒也不能通過汁液摩擦侵染這些指示植物。

3討論

通過對浙江麗水、杭州兩地田間百合各栽培品種EIASA檢測，查明CMV在東方百合、亞洲百合、百合鐵亞雜種及甜百合上普遍發生，感病率達40．6％。電鏡觀察，田間CMV感染的樣品大多含有線狀病毒，CMV與線狀病毒的復合侵染率為35．9％，具有病毒多樣性的特點。田間百合發病情況復雜，癥狀表現不規律，往往是多種癥狀復合表現。此外，發病癥狀還與溫度有關，溫度過低(<5℃)或過高(>30℃)時，癥狀表現不明顯。寄主反應試驗結果顯示，從百合上獲得的CMV分離物不能通過汁液摩擦接種侵染昆諾藜、莧色藜、普通煙、心葉煙等常規CMV指示植物，可能是CMV長期侵染百合，發生了對自‘合植物的寄主適應性變異，完全喪失了通過汁液摩擦傳播的特性。此外，在表現黃扁癥狀的百合植株中未檢測到線狀病毒和CMV，可能是其他病因所致。

CMV作為侵染百合的主要病毒之一，在世界上已有不少報道。Benetti等報道CMV在意大利百合上廣泛發生，并且常與LSV復合侵染。Kim等用組織吸附免疫的方法檢測侵染百合的CMV，并指出來自百合的分離物不能使茄科和葫蘆科等易被CMV侵染的作物發病，是相對獨立的一個類群。Cohen等報道CMV是以色列百合主要病毒之一。Korbin等研究了波蘭觀賞植物上的CMV分離物特性，發現百合等植物上分離的CMV不能通過汁液摩擦使CMV系統與鑒別寄主發病，喪失了通過汁液摩擦接種傳播的特性。Masuta等報道了日本和韓國侵染百合的兩個CMV分離物，其寄主范圍僅限于百合，不能通過汁液摩擦接種傳播。本試驗結果與之吻合。

侵染百合的病毒寄主范圍往往都比較窄。根據本研究結果，CMV在百合上已形成了株系分化，或在長期無性繁殖過程中喪失了通過汁液摩擦傳播的能力，因而很難像侵染其他植物的CMV株系那樣通過生物接種進行分離、鑒定與檢測。在進行百合脫毒處理和病毒研究過程中需要結合分子雜交等其他分析手段進行診斷檢測。因此，通過分子生物學方法對侵染百合的CMV以及其他病毒進行基因組序列研究，不僅可以確定其進化親緣關系及產生寄主適應性變異的分子基礎，同時也將為生產健康優質的百合提供條件。