多粘芽孢桿菌ＪＷ—７２５抗菌活性物質及其發酵條件的初步研究

趙德立　曾林子　李　暉　陳金瑞　劉成君

摘要多粘芽孢桿菌Jw—725對柑橘青霉具有很強的拮抗作用。通過5因素4水平正交試驗明確，應用LB培養基培養，初始pH 9．o，30℃．通氣量loomL接種量為10％．140 r／min振蕩培養?2h時的發酵液具有最佳抗苗活性。該菌胞外抗菌物質可用乙酸乙酯單一溶劑提取。

關鍵詞生物工程；多粘芽孢桿菌；抗真菌活性物質；發酵條件

中圖分類號S 482．212

芽孢桿菌具有抗菌防病作用和很強的抗逆能力，其中許多性狀優良的拮抗菌株已成功地應用于植物病害防治。芽孢桿菌抗菌防病機制包括競爭作用、拮抗作用和誘導植物抗病性，其中拮抗作用是其最主要的抗菌機制。芽孢桿菌產生的抗菌物質主要有幾丁質酶和葡聚糖酶等蛋白、抗菌肽以及一些次生代謝產物。

柑橘青霉菌是柑橘貯藏期和運輸期中的重要病原真菌，通常用甲基托布津、多菌靈等化學藥劑防治。研究柑橘病原真菌的拮抗菌，為解決病原菌對化學農藥的抗藥性和果品農藥殘留問題，尋找新的途徑。

1材料和方法

1．1材料

1．1．1拮抗菌

多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymy,ra jW—725)由本實驗室從西藏類烏齊協馬高山口草甸(海拔4671m)土樣篩選得到。

1．1，2病原指示菌

柑橘青霉菌(Penicillicum italicum)為本實驗室分離保存。

1．1．3培養基

(1)LB培養基：酵母膏5．0 g，蛋白胨10．Og，NaCl 10．0g蒸餾水1000 mL，pH 6．0—9．0．121℃滅菌20min。

(2)PDA培養基：20％馬鈴薯汁100ML葡萄糖2.0g，瓊脂2.0g，pH 6．0～7．O，115℃滅菌30min。

(3)NA，BPY，YPG培養基.

1．2方法

1．2．1同步培養抑菌試驗

在PDA平板上接指示菌柑橘青霉菌孢子和多粘芽孢桿菌JW 725各1環。兩點相距5 cm，27亡恒溫培養粕正放培養3d，觀察結果。

1．2．2多粘芽孢桿菌液體培養

種子培養：接種B．pol3wO,．roJW 725單菌落到20 n、I。液體LB(100ML三角瓶)，30℃，140 r／min，振蕩培養48h發酵培養：10％接種量，接種子培養液到100血。液體I衛培養基中(500mI三角瓶)。30℃，140r／min，振蕩培養72h。

1．2．3抑菌活性的檢測

抑菌圈測量采用牛津環法和打孔法。

1．2．4蛋白濃度的測定應用考馬斯亮藍法。

1．2．5抑菌作用觀察

肉眼觀察p．italicum的菌落正常菌絲和受拮抗菌抑制后的形態、顏色變化；分別挑取正常戶．italicum幼齡菌絲、產孢菌絲及受拮抗菌抑制的菌絲制片，石炭酸美蘭染色，100倍油鏡觀察具微觀形態變化。

1．2．6正交法確定多粘芽孢桿菌最佳發酵條件…

考察5個因素：培養基種類、初始pH、培養時間、通氣量及接種量對多粘芽孢桿菌JW 725產生拮抗物質的影響，并通過比較得到5因素的最佳配比。

按正交表5因素4水平安排試驗，取不同培養條件下的發酵液，分別測菌液吸光值(()Doso)，無菌發酵液的粗蛋白吸光值(OD)和發酵液的抑菌活性(抑菌圈直徑)。

1．2．7拮抗菌生長曲線與抑菌時程曲線

于不同時刻，分別取多粘芽孢桿菌JW－725LB發酵培養液，測定菌懸液吸光值(OD₅₈₀)和測量抑菌圈直徑大小。

1．2．8發酵液中抗菌活性物質的定位

(1)胞內發酵液離心得菌體，經超聲波破壁和石英砂研磨破壁，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為破壁緩沖液，離心并作無菌過濾，得無菌破碎液，做抑菌試驗，測量抑菌圈。

(2)胞外用真空旋轉蒸發儀濃縮無菌濾液，濃縮100倍，做抑菌試驗，測量抑菌圈。

(3)孢子平板上放置一張無菌濾膜，上面點多粘芽孢桿菌jW—725單菌落，正放，培養2～3 d，揭濾膜，觀察抑菌情況。

1．2．9抗菌活性物質的提取

(1)飽和硫酸銨沉淀

發酵液用飽和度日80％硫酸銨沉淀，PBS緩沖液稀釋，經o．22um徑無菌濾膜過濾得無菌蛋白濾液，4℃冰箱保存。用粗蛋白液做抑菌實驗，無菌LB液體培養基做對照。

(2)乙酸乙酯抽提和濃縮

發酵液離心上清，加等體積乙酸乙酯于分液漏斗中振蕩混勻過夜，收集乙酸乙酯層并轉入球形漏斗，真空旋轉蒸發濃縮，用少量無菌水洗出。用該濃縮液做抑菌實驗，無菌水做對照。

2結果

2．1同步培養抑菌試驗

多粘芽孢桿菌JW～725在PDA平板上對柑橘青霉有較強抑菌力，如圖1。同步對峙培養3 d后，病原菌柑橘青霉長勢較快，漫布大部分平皿；拮抗菌多粘芽孢桿菌的菌落直徑約1 Chl，其與病原真菌接觸方向，有明顯透明弧形抑菌帶，帶寬1．o一1．5cm。

2．2多粘芽孢桿菌發酵液對柑橘青霉菌的影響

在PDA含柑橘青霉菌孢子平板上打孔，加多粘芽抱桿菌發酵液，培養3d后，平板上出現抑菌圈“雙圈”現象，內圈有柑橘青霉菌增生堆積；外圈柑橘青霉菌菌絲由幼齡白色變為成熟的青綠色，并從抑苗圃邊沿開始，由內向外變為枯黃色，而正常菌絲則保持青綠色至長滿孢子。

顯微鏡下油鏡觀察，抑菌圈周圍被抑制的柑橘青霉菌菌絲有大量異常分支，分支菌絲較短，但未見菌絲有明顯破裂現象。

2．3最佳發酵條件正交試驗結果及分析

分別對多粘芽孢桿鹵JW-725菌株濃度，蛋白質含量，發酵液抑菌圈直徑的正交試驗結果按文獻L11)進行直觀分析。由表2可知，發酵條件5因素對多粘芽孢桿菌JW—725菌體濃度的影響，大小順序為：通氣量>培養時間>培養基>接種量>培養基初始pH。對發酵液蛋白含量的影響，大小順序為：培養基>接種量>培養基初始pH>培養時間>通氣量。

發酵條件5種因素對多粘芽孢桿菌JW—725發酵液活性的影響大小順序為：培養基>接種量>培養基初始pH>培養時間>通氣量。

試驗也發現5種因素4水平的多粘芽孢桿菌JW 725最佳抑菌活性的發酵條件為：LB培養基，初始pH9，通氣量100 mi接種量Io％，發酵時間72h。

2．4多粘芽孢菌桿生長曲線和抑菌時程曲線

如圖2所示，多粘芽孢菌桿JW—725在培養18h時達到菌體最大濃度，從菌體開始生長到穩定期，發酵液中都有抑菌活性，12h有最大抑菌活性。圖2多粘芽孢桿菌Jw—725發酵液OD值與抑菌活性曲線

2．5抗菌活性物質的定位

經過多種方法破碎多粘芽孢桿菌JW-725細胞，無菌細胞破碎液均沒發現有明顯抑菌圈。發酵上清液，經o．22um孔徑濾膜過濾，也未發現有明顯抑菌圈。將無菌濾液經真空旋轉蒸發濃縮100倍后，有明顯抑菌圈出現。

直接在無菌濾膜上點拮抗菌平板培養發現，膜上拮抗菌菌落直徑5 mm，膜下產生直徑13 mm抑菌圈。表明多粘芽孢桿菌JW-725產生抗菌物質，泫活性物質能夠透過o．22um孔徑濾膜。

2．6抗菌活性物的提取

1)發酸液經過80％硫酸銨沉淀，蛋白粗提液未經過濾膜過濾的有明顯抑菌活性；但經濾膜過濾后未表現有明顯抑菌活性。

2)發酵液經乙酸乙酯抽提濃縮，無菌水稀釋做抑菌實驗，有明顯抑菌活性。

在I．B固體平板上涂布少量乙酸乙酯抽提濃縮液，未發現有多粘芽孢桿菌長出，排除可能殘留菌體的影響，表明乙酸乙酯可把發酵液中抑菌物質初步抽提山來。

3討論

不同測量方法時發酵液抑菌活性測定有不問結果。相同發酵液樣品，用打孔法的抑菌圈比牛津環法的抑菌效果明顯，抑菌圈大，且有雙圈現象。柑橘青霉菌菌絲受多粘芽孢桿菌和拮抗物質共同影響．顏色發生異常變化。這種異常變化能在正常菌絲產生擴散，引起擴散的原因是否是因為拮抗物質在菌絲中的擴散還是柑橘青霉菌的某種信號傳導，有待確定；汕鏡下觀察發現，柑橘青霉菌堆積的菌絲有大量異常分支，但未發現有菌絲破裂現象。

多粘芽孢桿菌體生長及其活性物質的積累：多粘芽孢桿菌培養18h后進入菌體生長穩定期，在菌體發酵后期，發酵液中抑菌活性略有增強。

拮抗物質與菌體的協同作用對抑菌活性的影響：發酵原液有明顯抑菌效果，發酵上清液(有殘留多粘芽孢桿菌)培養2d后，孔內或圈內明顯有菌體生長，也有較強抑菌活性，其無菌濾液培養2d后無明顯抑菌效果，而濾液濃縮后有抑菌效果。發酵液離心上清經過乙酸乙酯抽提，可抽提到拮抗物質。這表明，多粘芽孢桿JW-725菌株產生拮抗物質的產量偏低，發酵液的抑菌活性是受到菌體本身和活性物質的雙重影響，并且多粘芽孢桿菌菌體本身對柑橘青霉菌的影響可能比較大。