小白菜自交不親和性相關基因的分子標記開發

賈永鵬　李霞　周國林等

摘要：以自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85為親本雜交獲得的F2分離群體為供試材料，采用BSA法結合SNP芯片技術，篩選出與自交不親和性相關的SNP標記，并將SNP差異位點序列信息與白菜基因組序列進行比對分析，并進一步開發SSR標記，共獲得了與自交不親和性相關的SSR分子標記BrA1-2、BrA1-3和BrA1-14，為分子標記輔助自交不親和性雜交種生產提供技術支持。

關鍵詞：小白菜；自交不親和性；SNP；分子標記

中圖分類號：S634.3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）08-0038-04

小白菜（Brassiea eampestris ssp.chinensis Makino）又稱不結球白菜，營養價值豐富，生長期短，在適宜環境條件下可進行周年種植，為我國長江中下游及南方地區種植的重要蔬菜種類之一。小白菜的自交不親和現象十分普遍，利用自交不親和系生產F₁代雜交種成為小白菜雜種育種的重要方法之一。但是，由于自交不親和的表型容易受到環境條件和植株生理狀況的影響，導致植株的親和性難以判斷，致使在配置雜交組合和種子生產時，費時費力，準確性差。利用分子標記輔助選擇，可以大大提高育種的效率。

小白菜自交不親和性主要由s位點復等位基因控制。當雄蕊花粉粒攜帶的s等位基因與雌蕊的基因相同時，花粉管生長受到抑制，表現出自交不親和；當花粉粒攜帶的s等位基因與雌蕊的基因不相同時，花粉管正常生長，表現為自交親和。在育種實踐中，能夠快速鑒定自交不親和性的S單元型至關重要。隨著分子生物學的發展，利用分子標記鑒定S單元型已成為目前主要的方法之一。前人做了很多研究，Nasrallah等利用SLG6的cDNA克隆作為探針，對多個不同S單元型的全基因組DNA進行RFLP分析，獲得了多個與S單元型連鎖的RFLPs標記，初步建立了一種利用DNA分子標記技術快速鑒定s單元型的方法，可以在苗期鑒定材料的S單元型，比田間更加可靠；Nishio等利用PCR-RFLP對10個白菜和10個甘藍材料的SLG基因多態性進行了分析，發現這種方法可以在十字花科的蔬菜中鑒定S單元型以及F₁雜種的純度。寇小培以甘藍型油菜為材料，利用與自交不親和基因連鎖的分子標記輔助選育油菜自交不親和系，最終得到了改良的甘藍型油菜自交不親和系。因此，分子標記在自交不親和性中的利用越來越重要，而開發新的自交不親和性標記成為當前的重點。

本研究以自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85為親本構建的F2分離群體為材料，采用BSA法和油菜60K SNP芯片雜交技術，對小白菜自交不親和性相關基因的分子標記進行設計與開發，為后續利用自交不親和性進行分子標記輔助育種提供可靠的理論依據與技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為自交親和系WS-199和自交不親和系WS-85（由武漢市蔬菜科學研究所栽培與采后室提供）為親本構建的F₂分離群體。于2014年9月底，將F₂群體種子播于大田，2015年1月將幼苗移栽到大棚中（武漢市黃陂區武湖基地），2015年3月進行套袋自交。所有材料依照田間常規方法進行種植和管理。

1.2試驗方法

①F₂群體親和性調查、DNA的提取及BSA混池構建 a.F₂群體親和性調查。在2015年3月對F₂群體中的開花植株進行套袋自交，調查植株的角果生長和膨大情況，以及植株的結實情況，最終判斷植株的親和性。

b.DNA提取。選取苗期的小白菜鮮嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA。用UV-1800 PC紫外分光光度計（上海譜達儀器有限公司）測定DNA濃度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，取部分原液稀釋到50 ng/mL作模板，其他放于-20℃保存備用。

c.BSA混池構建。從群體中選取性狀明顯的親和系植株和不親和系植株各17株，采用DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，產品編號DP320）提取DNA，且DNA樣品保存在-80℃。利用組群分離分析法（BSA）構建不親和池與親和池，對DNA進行等量混合，構成4個不親和基因池與4個親和基因池，用于芯片分析及后續引物篩選。

②SNP芯片設計采用油菜60K SNP芯片進行雜交。a.DNA定量、擴增。放在0.1 mol/L NaOH中變性，加入MA2和MSM，放在37℃雜交爐中擴增20～24 h。

b.DNA片段化。加入FMS，在37℃干浴鍋1 h。

c.DNA富集。加入155μL異丙醇，在4℃冰箱中放置30 min，倒出液體，室溫下干燥1 h。

d.DNA片段回收。加入RA1，用銀箔紙封口，在48℃雜交鍋中培養1 h。

e.DNA變性。在干浴鍋于95℃下變性20 min。

EDNA與芯片雜交。準備雜交盒，在芯片的每個樣品孔點樣12 μL，放在48℃雜交爐中16～24 h，轉速調至5檔。

g.洗芯片與染色。

h.芯片掃描。采用BeadArray Reader激光共聚焦掃描系統，并進行數據分析。

③SSR引物設計及篩選通過芯片數據分析處理，將獲得的差異序列和白菜基因組進行Blast對比分析，選取同源序列相似度高的基因序列區段，進行下一步SSR引物的開發，并提交到http：∥wsmartins.net/websat/數據庫。SSR引物由上海生工工程公司（武漢）合成。

PCR反應體系：DNA模板1 μL，引物1μL，10xPCR Buffer 1μL，dNTPs 0.2 μL，Mg²⁺0.8 μL，Taq聚合酶0.2μL，用ddH20補充至10 μL。PCR擴增反應程序：94℃3 min；94℃ 30 s，55～56℃ 30 s，72℃30 s，35個循環；72℃ 10 min；25℃ 30 min。將擴增產物采用6%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳檢測，在電壓200 V下70～80 min后，進行銀染和顯影，用清水沖洗干凈。在室溫下自然晾干，統計擴增條帶，并拍照保存。

2結果與分析

2.1 SNP芯片分析

對不同混池間芯片分析后，將SNP數據經Genome Studio軟件進行基因分型處理，通過不親和與親和數據之間的比較分析，共獲得100個差異位點，然后從芯片對應數據庫中下載這100個差異位點序列，將下載的100個差異位點序列和白菜基因組進行對比，選取同源序列相似度大于98%的位點數據。分析表明，這些位點主要集中分布在白菜基因組的第1連鎖群（2517 659～24 006 839）和第10連鎖群（8 961 370-16 442 481）。

2.2 SSR分子標記開發

針對第1和第10連鎖群上包含的差異堿基序列區段，在線設計SSR引物32對，部分引物序列如表1。將32對引物在親和池與不親和池中進行DNA擴增，共有3對引物BrA1-2、BrA1-3和BrA1-14在混合池中表現出多態性（圖1）。

2.3群體單株驗證

利用引物BrA1-2對F₂群體中的親和單株進行驗證。結果表明，90株親和單株中僅有2個交換單株，遺傳距離約2.2 cM（圖2）。

3討論與結論

Batemant4]首次提出了關于自交不親和性受單位點復等位基因控制的遺傳模式，為自交不親和性研究奠定了重要基礎。在s復等位基因位點上包含有S位點特異性糖蛋白SLG、S位點受體激酶SRK、S位點富含半胱氨酸蛋白SCR和SP11。當花粉中的SCR或SP11與柱頭中的SRK、SLG相互識別，引發了自交不親和反應。葛婷婷㈣利用不結球白菜（矮腳黃）002和210為親本，構建了F₂分離群體，開發到了一個與自交不親和基因連鎖的分子標記BrSS15。Katsunori等利用Kal-22（Brasscia rapa substx rapa）和Hal-400（B.rapa substp.pekinensis）構建了F₂群體，通過對群體進行2 a的自交不親和性調查和統計，結合884對SSR標記和55對SNP與indel標記進行了自交不親和性的QTL分析，定位到了5個高度不親和性QTL位點BrHLSI-1、BrHLSI-2、BrHLSI-3、BrHLSI-4和BrHLSI-5，它們分別分布在白菜第7、3、2、10、6連鎖群上，而BrPUB8在第1連鎖群。BrPUB8是PUB8的同源基因，而PUB8可能是調控假性自花授粉植物自交不親和性的關鍵基因。

隨著全基因組序列鑒定技術的快速發展，SNP標記作為最新分子標記類型，具有密度高、分布范圍廣、分型簡單等優點，在分子遺傳研究中逐漸興起，已成功應用在油菜QTL定位和全基因組關聯分析的研究當中。而在白菜研究上，目前，利用油菜60K SNP芯片技術開發標記非常少見。由于進行傳統的雜交測試（親和指數法）時，植株結實會受到外界環境的影響，因此親和性難以判斷，耗費較長的時間和較多的人力。本研究將BSA分析法和SNP芯片技術結合起來，對小白菜中普遍存在的自交不親和現象進行快速標記開發，并能較快應用于自交不親和基因類型的鑒定，加快育種的進程，為白菜雜交組合的配置和實現傳統育種與分子育種的結合提供參考。