電針對(duì)大鼠腦局部缺血再灌流后c-fos、mRNA表達(dá)的影響

王　利　張學(xué)勤　張　勇　盧志達(dá)

(崇文區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,北京100061;1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院)

摘要采用Wistar大鼠,線栓法制作腦局部缺血再灌流動(dòng)物模型,以原位雜交技術(shù)及蘇木素-伊紅(HE)染色方法,觀察電針對(duì)缺血側(cè)額葉、頂葉及海馬各區(qū)內(nèi)c-fos、mRNA表達(dá)并神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)改變的影響。結(jié)果表明,電針能顯著增強(qiáng)腦局部缺血再灌流后病灶側(cè)額、頂葉皮層及海馬各區(qū)c-fos、mRNA表達(dá),并能減少缺血再灌流損傷后上述各腦區(qū)神經(jīng)元的變性壞死。結(jié)果提示電針對(duì)腦局部缺血后受損神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與增強(qiáng)了c-fos、mRNA的表達(dá)有關(guān)。

主題詞電針腦缺血/針灸療法c-fos類/代謝RNA,信使/代謝再灌注損傷原癌基因蛋白質(zhì)

c-fos基因是細(xì)胞內(nèi)快反應(yīng)基因,在神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損害時(shí),呈一過性表達(dá)。目前,c-fos表達(dá)已被作為特定刺激下神經(jīng)元功能活動(dòng)的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)研究采用更接近腦卒中臨床實(shí)體的腦局部缺血再灌流動(dòng)物模型,運(yùn)用祖國(guó)醫(yī)學(xué)的針刺方法,結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段,旨在從分子生物學(xué)的角度為腦卒中后極早期的針刺治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性Wistar大鼠(由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重200～250 g。動(dòng)物麻醉采用3.5%水合氯醛,350 mg/kg腹腔注射。麻醉過程中以烤燈維持動(dòng)物肛溫在36.5～37.5 ℃。

1.2動(dòng)物模型制備及分組

1.2.1模型制備采用改良線栓法制作大鼠可逆性左側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCA)缺血再灌流動(dòng)物模型。步驟如下:大鼠麻醉成功后,仰臥固定于手術(shù)平臺(tái)上。頸部正中開窗,分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。于ECA近分叉處做一小切口,插入尼龍線至ICA內(nèi)約17 mm,結(jié)扎固定。再灌流時(shí)拔出栓子。

1.2.2動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)用大鼠隨機(jī)分為4組,即:缺血再灌流組(n=5,缺血1 h+再灌注1 h);缺血再灌流+電針組(n=5,缺血1 h+再灌流1 h+電針0.5 h);假手術(shù)組(n=3,單純分離血管);假手術(shù)+電針組(n=3,假手術(shù)+電針0.5 h)。

1.3針刺處理

1.3.1取穴依照大鼠經(jīng)穴定位法,選取"百會(huì)"、"風(fēng)府"2穴。

1.3.2刺法大鼠麻醉后,取腹臥位固定于手術(shù)平臺(tái)上。"百會(huì)"穴以毫針向前斜刺2.5 mm,"風(fēng)府"穴以毫針向后斜刺2.0 mm。針刺后以WQ-6F型電針儀給予電壓為4.5 mV,間斷頻率15次/min,f1為6 Hz,f2為8 Hz兩種頻率交替的等幅疏密波電刺激。電針于左側(cè)MCA閉塞后30 min開始,持續(xù)30 min。缺血再灌流組大鼠亦于同時(shí)相麻醉、固定,持續(xù)時(shí)間與缺血再灌流+電針組等長(zhǎng)。

1.4c-fos、mRNA檢測(cè)

1.4.1原位雜交于實(shí)驗(yàn)?zāi)┞樽韯?dòng)物,經(jīng)心腔依次灌注0.9%生理鹽水及以0.01 mol/L磷酸緩沖液生理鹽水(PBS)配制的4%甲醛溶液。斷頭取腦,置于4%PBS甲醛溶液中固定48 h。將鼠腦自額極向后至枕極冠狀切為A、B、C、D、E 5個(gè)等份;依次行酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。取C、D腦片連續(xù)切片,片厚5 μm,貼附于預(yù)先涂有光學(xué)樹脂膠(APFS)的載玻片上,用原位雜交技術(shù)進(jìn)行染色。c-fos探針及鏈酶蛋白酶/辣根過氧化物酶(S-A/HRP)標(biāo)記物抗體試劑盒均購(gòu)于北京中山試劑公司。具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。陰性對(duì)照以羊血清代替c-fos探針。

1.4.2觀察方法于C、D腦片連續(xù)切片中每隔6張取1張,共取10張;每張切片觀察10個(gè)高倍視野(OLYMPUS BH-2型光學(xué)顯微鏡,×400倍),以測(cè)微尺計(jì)數(shù)c-fos、mRNA陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5HE染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水,HE染色,光鏡下觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,以分組t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。數(shù)據(jù)處理采用SYSTAT軟件包。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)元c-fos、mRNA表達(dá)

c-fos、mRNA表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞,胞核呈深棕色,胞漿不著色。假手術(shù)組與假手術(shù)+電針組在左側(cè)各腦區(qū)內(nèi)的c-fos、mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均極少,兩組間差異無(wú)顯著性意義。與假手術(shù)組比較,缺血再灌流組與缺血再灌流+電針組左側(cè)各觀察腦區(qū)c-fos、mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均極顯著增加。兩組均以額葉、頂葉皮層的Ⅱ～Ⅴ層神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)更為強(qiáng)烈。與缺血再灌流組比較,電針組病灶側(cè)各腦區(qū)c-fos、mRNA增加更為明顯,尤以齒狀回、額葉、頂葉皮層為著,海馬CA1、CA4區(qū)神經(jīng)細(xì)胞c-fos、mRNA陽(yáng)性表達(dá)亦有顯著增加(見表1)。

2.2組織形態(tài)學(xué)改變

石蠟切片HE染色后光鏡下觀察所見:假手術(shù)組與假手術(shù)+電針組皮層及海馬各區(qū)內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)正常。缺血再灌流組病灶側(cè)額葉、頂葉皮質(zhì)部分組織水腫,多數(shù)神經(jīng)元胞漿紅染,胞核呈不規(guī)則形固縮、深染,神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死明顯;在海馬及齒狀回各區(qū)內(nèi)亦可見部分神經(jīng)細(xì)胞胞漿紅染,胞核固縮,細(xì)胞變性、壞死。電針組病灶側(cè)皮層僅見少量神經(jīng)細(xì)胞胞漿紅染,細(xì)胞腫脹,核固縮,但其數(shù)量明顯少于缺血再灌流組;海馬及齒狀回內(nèi)極少神經(jīng)細(xì)胞有輕度萎縮,胞漿紅染。

3討論

c-fos基因是即早基因(immediate-early genes,IEGs)家族的一員。近年來(lái)的研究表明,在正常情況下,c-fos基因參與細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖分化、信號(hào)傳遞、學(xué)習(xí)與記憶等生理過程,在絕大多數(shù)細(xì)胞包括神經(jīng)元中呈極低表達(dá);病理情況下,c-fos基因的表達(dá)及調(diào)控變化與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。c-fos基因可被一過性腦缺血所誘導(dǎo),雖然在細(xì)胞對(duì)缺血的反應(yīng)中,c-fos的作用機(jī)制尚未被完全闡明,但c-fos可以改變?cè)S多基因的表達(dá),提示它可作為存活機(jī)制的一部分,參與針對(duì)損害的遺傳信息的產(chǎn)生。c-fos作為核內(nèi)第3信使分子,通過特殊靶基因的表達(dá),能將細(xì)胞外短期的刺激信號(hào)轉(zhuǎn)換為長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞功能改變,從而對(duì)細(xì)胞分化和可塑性起重要作用。缺血后神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)受到破壞,特殊基因表達(dá)的改變,特別是能引導(dǎo)上調(diào)其它基因的c-fos等IEGs的表達(dá)改變,使神經(jīng)元達(dá)到特定的可塑性,以整合缺血后的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò),使被破壞的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)得以重建,恢復(fù)正常功能。腦缺血后誘導(dǎo)c-fos、mRNA表達(dá)的影響因素很多,其中之一是腦血流量。許多大鼠MCA閉塞模型實(shí)驗(yàn)表明,c-fos、mRNA在缺血中心呈低表達(dá)或不表達(dá),而在缺血半暗帶和遠(yuǎn)離缺血區(qū)未受損的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)呈一過性高表達(dá)。在這兩類不同區(qū)域中,IEGs在神經(jīng)元中的表達(dá)標(biāo)志著神經(jīng)元將存活。由此說(shuō)明,在缺血區(qū)內(nèi)能幸免于缺血損害的細(xì)胞存在c-fos誘導(dǎo)與表達(dá),而一定量的局部腦血流則是產(chǎn)生表達(dá)的必要條件。

本研究采用原位雜交技術(shù)觀察了Wistar大鼠腦局部缺血1 h繼以再灌流1 h病灶側(cè)額葉、頂葉、海馬各區(qū)內(nèi)c-fos、mRNA的表達(dá)及電針對(duì)其產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明,假手術(shù)及假手術(shù)+電針組大鼠各腦區(qū)的c-fos、mRNA表達(dá)水平低下。缺血再灌流組病灶側(cè)大腦額葉、頂葉皮層的Ⅱ～Ⅴ層神經(jīng)細(xì)胞及海馬齒狀回各部位均有大量c-fos、mRNA表達(dá),電針處理組病灶側(cè)各相應(yīng)腦區(qū)內(nèi)c-fos、mRNA的表達(dá)呈顯著性增加(見表1)。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)告相一致。光鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察所見,電針處理后病灶側(cè)上述各腦區(qū)的神經(jīng)元變性壞死數(shù)目較之缺血再灌流組明顯減少,程度亦減輕,提示電針處理對(duì)缺血神經(jīng)元有良好的保護(hù)作用。由于針刺可以使缺血局部的血管阻力下降,增加腦缺血部位的血流量,從而使c-fos、mRNA的表達(dá)增加,受損神經(jīng)元得到保護(hù),減輕了腦缺血再灌流后的神經(jīng)元損傷。影響c-fos、mRNA在腦缺血后誘導(dǎo)表達(dá)的因素還有(1)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的激活,(2)細(xì)胞內(nèi)Ca++的增多,(3)擴(kuò)展性抑制等。針刺的作用是否還涉及上述方面,尚需進(jìn)一步研究以證實(shí)。近年來(lái)的一些實(shí)驗(yàn)研究表明,電針療法對(duì)腦缺血再灌流損傷確有保護(hù)作用,可以改善腦缺血再灌流后神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙,減輕腦水腫及缺血后神經(jīng)元損傷,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果提示,電針對(duì)腦局部缺血再灌流所造成的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與電針增加c-fos、mRNA表達(dá)有關(guān)。

本研究所選用的穴位"百會(huì)"及"風(fēng)府"均為督脈之穴。依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)的理論,治療中風(fēng)選取督脈經(jīng)穴,主要在于督脈總督一身之陽(yáng)脈,為"陽(yáng)脈之海";督脈上行至風(fēng)府,入于腦,故和腦有密切的關(guān)系。針刺督脈可以振奮周身之陽(yáng)氣,疏通經(jīng)絡(luò)、健腦補(bǔ)髓、醒腦開竅,從而達(dá)到治療之目的。

(收稿日期:1999-04-22,齊淑蘭發(fā)稿)