電針對(duì)大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)元損傷保護(hù)作用的研究

許能貴　易　瑋等

△許能貴易瑋馬勤耘許冠蓀朱舜麗陳全珠(安徽中醫(yī)學(xué)院針灸經(jīng)絡(luò)研究所,合肥230038)

摘要選擇凝閉大鼠大腦中動(dòng)脈致局灶性腦缺血為模型,觀察電針對(duì)缺血區(qū)各指標(biāo)的影響。結(jié)果:①造模60min后,局部腦血流量(rCBF)、超氧化物歧化酶(SOD)、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)均顯著下降;腦組織水含量、丙二醛(MDA)、興奮性氨基酸(EAA)中谷氨酸(Glu)和天門冬氨酸(Asp)明顯升高。②電針10min后,上述指標(biāo)均得到改善。提示電針可升高rCBF、SOD活性和中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì),降低MDA、Glu、Asp和腦組織的水含量,從而保護(hù)腦缺血后繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。

主題詞電針腦缺血/針灸療法神經(jīng)元/針灸效應(yīng)

腦血管疾病是目前公認(rèn)的人類三大致死疾病之一,其中缺血性腦血管疾病發(fā)病率在我國(guó)高達(dá)70%,國(guó)外高達(dá)80%以上。由于腦缺血后神經(jīng)元損傷一旦達(dá)到不可逆階段,就無法自然修復(fù),后果嚴(yán)重,因而探討其有效的防治措施和發(fā)病機(jī)理,是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇凝閉大腦中動(dòng)脈致大鼠局灶性腦缺血為模型,以rCBF、腦組織水含量、SOD、MDA、腦內(nèi)EAA和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)等為指標(biāo),觀察電針對(duì)其影響,并進(jìn)一步探討電針防治缺血性腦損傷的機(jī)理。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康Wistar大鼠,體重200～300 g,雌雄不拘,由安徽中醫(yī)學(xué)院針灸經(jīng)絡(luò)研究所標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、缺血組、缺血加電針組。

1.2模型建立

將動(dòng)物用10%水合氯醛溶液,按400 mg/kg量腹腔麻醉,取右側(cè)向上側(cè)臥位固定,沿耳眼連線中點(diǎn)切開皮膚,分離顳肌,暴露顳骨作一骨窗,輕抬腦,暴露大腦中動(dòng)脈,用燒紅的不銹鋼絲輕觸大腦中動(dòng)脈,使之凝閉,清創(chuàng)縫合傷口,待測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

假手術(shù)對(duì)照組:只作手術(shù),不凝閉大腦中動(dòng)脈。

缺血組:造模后60 min將大鼠迅速斷頭處死,取出大腦,然后按各指標(biāo)所要求的部分進(jìn)行分離切割,稱重,備用。

缺血加電針組:在缺血60 min后,再電針"大椎"、"百會(huì)"穴10 min(穴位定位參照大鼠常用的針灸穴位琜1])。"大椎"穴在第七頸椎與第一胸椎間,背部正中;"百會(huì)"穴在頂骨正中。電針應(yīng)用我所研制的PCE-A型程控電針儀,5～10次/s,疏密波,強(qiáng)度以大鼠輕度顫動(dòng)為度,時(shí)間10 min。

1.3局部腦血流量測(cè)定

用筆者使用過的方法琜2]進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。鉑金絲電極從大鼠右側(cè)顱骨打孔后插入。

1.4腦組織水含量測(cè)定

以干濕法琜3]測(cè)腦組織水含量。將斷頭取出的右側(cè)額頂葉腦組織立即放在分析天平上稱取濕腦重(wt),然后在100 ℃±2 ℃烤箱中烤至恒重,再稱取干腦重。根據(jù)公式計(jì)算腦水分百分含量值:

1.5SOD活性及MDA含量測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)程序?qū)⒋笫笱杆贁囝^取右側(cè)額頂葉腦組織,以4 ℃生理鹽水制成10%勻漿液,離心取上清液測(cè)定。SOD采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定,試劑盒由武漢海軍抗衰老研究中心提供。MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定,試劑盒由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6腦內(nèi)興奮性氨基酸含量測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)程序,將大鼠斷頭處死,迅速取右側(cè)額頂葉腦組織,稱重,加4%磺基水楊酸5 ml勻漿,置高速冷凍離心機(jī)離心,10 min取上清液上機(jī)待測(cè)。用日立835-50型氨基酸分析儀測(cè)試EAA含量。微型計(jì)算機(jī)控制自動(dòng)進(jìn)樣。數(shù)據(jù)用834數(shù)據(jù)處理機(jī)處理。

1.7中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)程序,將大鼠斷頭處死,迅速取出全腦,分離各腦區(qū)(皮質(zhì)部取右額頂葉部分皮質(zhì),約相當(dāng)于半球的前1/3部分,腦干部取全腦干),立即冷凍,然后參照何美霞等方法琜4],用正丁醇、庚烷勻漿分離后提取,日本島津-MPF-4型熒光分光光度計(jì)測(cè)定NE、DA和5-HT的含量。

2結(jié)果

2.1電針對(duì)rCBF、腦組織水含量、SOD和MDA含量的影響

造模致大鼠局灶性腦缺血60 min后,在缺血區(qū),局部腦血流量有非常顯著下降(P<0.01),腦組織水含量也明顯增高(P<0.01),SOD活性顯著下降(P<0.05),MDA含量明顯升高(P<0.05)。而在缺血加電針組中,經(jīng)過電針治療10 min后,則rCBF顯著升高(P<0.05),腦組織水含量明顯下降,SOD活性明顯增強(qiáng)(P<0.01),MDA含量則顯著下降,和假手術(shù)組相比,差異均無顯著性意義(P>0.05)。見表1、表2。

2.2電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠EAA含量的影響

凝閉大腦中動(dòng)脈致局灶性腦缺血60 min后,在缺血區(qū),Glu和Asp均升高,和假手術(shù)對(duì)照組相比,差異有非常顯著性意義(P<0.01)。給予電針10 min后,則Glu、Asp明顯下降,和缺血組相比,差異具有顯著性意義,和假手術(shù)組相比,差異無顯著性意義(P>0.05)。見表3。2.3電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

局灶性腦缺血大鼠在缺血60 min后,缺血區(qū)(皮質(zhì)部)都出現(xiàn)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)較假手術(shù)組的含量降低,以DA、5-HT下降最為明顯(P<0.01),NE也有明顯下降(P<0.05)。而在缺血加電針組中,則發(fā)現(xiàn)均有非常明顯升高(P<0.01)。在非缺血區(qū)(腦干),造模后單胺類神經(jīng)遞質(zhì)( 除DA外)無明顯變化(P>0.05),但給予電針10 min后,則出現(xiàn)不同程度的升高趨勢(shì)。見表4。

3討論

缺血性腦損害的中心問題之一是氧和能量的耗竭。增加腦組織氧和血流的供應(yīng)量,是防治缺血性腦損害的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),大鼠在局灶性腦缺血時(shí),rCBF大幅度下降,但給予電針10 min后,則rCBF顯著升至正常水平,和假手術(shù)組相比,差異無顯著性意義(P>0.05)。提示電針可改善腦血流量,阻止腦缺血后血流量的下降,從而保護(hù)缺血性腦神經(jīng)元的損傷。這與電針調(diào)節(jié)腦血管運(yùn)動(dòng)平衡,使腦血流量增加、腦組織氧含量和能量代謝得到改善有關(guān)。

腦水腫是缺血性腦損傷的主要病理之一,因而減輕腦水腫是改善缺血性腦損傷的重要標(biāo)志之一琜5]。實(shí)驗(yàn)觀察到,局灶性腦缺血大鼠在造模60 min后,在缺血區(qū)腦組織水含量明顯升高,電針10 min后腦組織水含量明顯降低,提示電針可減輕腦水腫,從而保護(hù)缺血性腦損傷。

眾多的研究證明琜6],氧自由基及其介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)是引起缺血性腦損傷的主要原因。腦缺血時(shí)由于大量氧自由基過耗了SOD,致使腦組織內(nèi)SOD活性降低,清除自由基能力下降,蓄積過剩的自由基與腦組織生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng),產(chǎn)生大量MDA,使腦組織生物膜結(jié)構(gòu)與功能受到損傷,從而引起細(xì)胞損傷直至死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在局灶性腦缺血大鼠的缺血區(qū),SOD活性較假手術(shù)組明顯下降,MDA含量顯著升高。但在缺血加電針組中,給予電針治療10 min,在缺血區(qū)腦組織中SOD活性明顯增強(qiáng),MDA含量也顯著下降。提示電針可提高腦缺血后腦內(nèi)SOD的活性,降低MDA含量,從而保護(hù)腦缺血神經(jīng)元的損傷。

Glu和Asp是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最高、分布最廣泛的EAA類神經(jīng)遞質(zhì)。現(xiàn)代研究證實(shí)琜7],EAA在缺氧、缺血、持續(xù)癲癇、腦外傷等所致急性神經(jīng)元損傷中起著關(guān)鍵性作用。正常情況下,細(xì)胞外EAA的濃度受神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的高攝取系統(tǒng)所控制,不會(huì)積累到致神經(jīng)元損傷的濃度。在上述幾種病理情況下,細(xì)胞外EAA濃度由于神經(jīng)元釋放增加,重?cái)z取減少和死亡細(xì)胞內(nèi)EAA大量溢出而大幅度增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),大鼠在局灶性腦缺血的缺血區(qū),Glu、Asp均有非常顯著性升高,給予電針督脈經(jīng)"大椎"、"百會(huì)"穴10 min后,缺血區(qū)腦組織內(nèi)Glu、Asp均有非常明顯降低,和缺血組相比,差異具有非常顯著性意義(P<0.01),和假手術(shù)對(duì)照組相比,差異無顯著性意義(P>0.05)。提示,電針可通過降低缺血區(qū)腦組織中的EAA,從而保護(hù)腦缺血后繼發(fā)神經(jīng)元的損傷。

多數(shù)的實(shí)驗(yàn)表明琜8],在腦缺血期,腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的含量降低,認(rèn)為含量降低的原因是受損傷的神經(jīng)軸索或神經(jīng)末梢突觸對(duì)單胺類遞質(zhì)的貯存和攝取功能減弱或喪失,大量的神經(jīng)遞質(zhì)釋放進(jìn)入突觸間隙和腦實(shí)質(zhì)中,并向血管周圍彌散,故腦中的含量下降。對(duì)腦血管疾病患者檢測(cè)血、尿及腦脊液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的升高現(xiàn)象也證明了這一點(diǎn)。結(jié)果與多數(shù)報(bào)道相似,大鼠在局灶性腦缺血后,缺血區(qū)(皮質(zhì)部)的NE、DA和5-HT的含量均降低,而在非缺血區(qū)(腦干部)則含量變化不明顯。給予電針刺激10 min后,則發(fā)現(xiàn)在缺血區(qū),可使NE、DA和5-HT非常明顯地上升直至接近正常水平。提示電針可升高中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì),糾正腦缺血后單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝紊亂,從而保護(hù)腦缺血性損害。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),在局灶性腦缺血大鼠的非缺血區(qū)(腦干)部位,除DA外,NE和5-HT的含量無明顯改變,但電針10 min后,其含量均有不同程度的升高。過去在針刺鎮(zhèn)痛研究中有過結(jié)果相一致的類似報(bào)道琜9],但在本實(shí)驗(yàn)中,這一結(jié)果是否有利于促進(jìn)保護(hù)腦缺血性損害尚有待進(jìn)一步研究。但不管怎樣,作為一種針刺治療或調(diào)整的效應(yīng)來講,應(yīng)該是有積極作用的。

本實(shí)驗(yàn)電針穴位選用督脈經(jīng)穴,是基于中醫(yī)學(xué)中的奇經(jīng)對(duì)整個(gè)經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)具有組合統(tǒng)率作用,督脈是奇經(jīng)八脈主體之一,是人體諸陽(yáng)經(jīng)之總匯,其所屬穴位主治適應(yīng)癥相當(dāng)廣泛,歷代醫(yī)家多有"病變?cè)谀X,首取督脈"之說,多年的針灸臨床證明,以督脈經(jīng)穴為主,治療缺血性中風(fēng),療效較好。

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