電針對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸血管紋琥珀酸脫氫酶的影響

康頌建　史獻君等

康頌建史獻君史永芝曾兆麟

(泰山醫學院生理聽覺研究室,山東271000;1泰山醫學院第一教學醫院;2上海中醫藥大學)

摘要將動物隨機分成3組:GE組動物肌肉注射慶大霉素,每天80 mg/kg;針刺組肌肉注射慶大霉素同GE組,每天電針雙側"聽宮"、"翳風"、"腎俞"穴1次;對照組動物不做任何處理。以腦干聽覺誘發電位(BAEP)和琥珀酸脫氫酶(SDH)組織化學檢測為指標。結果:對照組BAEP反應閾無明顯變化,耳蝸血管紋SDH染色呈紫藍色;GE組動物BAEP反應閾明顯升高,SDH顯色變淡或消失;針刺組BAEP反應閾升高幅度及血管紋SDH顯色變化明顯低于GE組。結論:電針能減輕GE耳毒性;對耳蝸血管紋SDH有保護作用。

主題詞耳蝸/酶學琥珀酸脫氫酶/針灸效應慶大霉素類/毒性電針

針刺治療耳聾是中醫學的傳統方法,對藥物性耳聾的防治作用已有報道,針刺有保護耳蝸酸性磷酸酶、ATP酶和琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性,對抗氨基糖甙類抗生素耳毒性的作用^[1,2]。針刺能否保護耳蝸血管紋SDH的活性,尚未見報道。本實驗主要觀察電針對慶大霉素(gentamicin,GE)致聾豚鼠耳蝸血管紋細胞SDH變化的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物分組選用耳郭反射正常,日齡45～65天,平均53天,體重為250～350 g的健康雜色豚鼠(由泰安生物制品研究所動物園提供),雌雄兼用,隨機分成3組:GE組10只,每天肌肉注射GE 80 mg/kg體重,連續注射20天;針刺組14只,肌肉注射GE同GE組,每天注射GE后1h給予針刺1次;對照組5只,不做任何處理,只作為耳蝸血管紋SDH的正常對照。

1.2腦干聽覺誘發電位測定用固定裝置固定豚鼠,測定清醒狀態下的豚鼠腦干聽覺誘發電位(BAEP)反應閾。用YJC-A型誘發電位儀測定用藥前和用藥及針刺后(隔5天測1次)BAEP反應閾。用短聲刺激,由聲刺激器輸入波寬為0.1 ms方波電脈沖經EPL-903型耳機輸出,10次/s。放大器通頻帶為80 Hz～3 kHz,增益2000,疊加200次。引導電極置顱頂部,參考電極及接地電極分別置于同側和對側乳突部。測定BAEP反應閾以IV波剛出現時的刺激強度dB值為反應閾值。

1.3針刺針刺動物處于清醒狀態,用固定裝置固定,針刺穴位參照文獻報道的實驗動物解剖學與人體穴位相應部位^[1],取雙側"聽宮"、"翳風"和"腎俞"穴,用電針刺激法(用G 6805-1型針刺治療儀,青島華聲儀器廠產),連續輸出,9次/s;刺激強度以針刺周圍組織顫動,動物能忍受為宜,持續刺激15 min,每天8時進行針刺,連續針刺20天。

1.4組織化學檢測停止用藥和針刺后1天,測定耳蝸血管紋SDH。SDH顯示采用硝基藍四氮鹽法,染色程序改變為適合于耳蝸組織顯色。作用液配方^[3]:0.2 mol/L琥珀酸15 ml,0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH為7.4)15 ml,0.1%硝基藍四氮鹽15 ml,上述各液用時混合即可。染色程序:麻醉動物后處死,立即取耳蝸,迅速在蝸尖部鉆孔,并將蝸窗和前庭窗開放,用0 ℃ 60%丙酮液灌流固定,用雙蒸餾水灌洗后,再灌流37 ℃作用液,然后將耳蝸置于37 ℃作用液中溫育1～2 h。將溫育后的耳蝸放于10%磷酸緩沖中性甲醛溶液中固定8 h以上,然后按照耳蝸螺旋韌帶硬鋪片技術做螺旋韌帶鋪片^[4],光鏡下觀察耳蝸血管紋SDH的變化。標本染色程度用721型分光光度計(上海第三分析儀器廠產)測定吸光度。各組動物SDH的測定都是在嚴格控制相同條件下進行的。

2結果

2.1BAEP閾變化GE組和針刺組動物在用藥后BAEP反應閾分別都發生不同程度的升高;在用藥前和用藥后20天比較,都有明顯差異。在用藥后20天組間比較,GE組升高明顯,針刺組升高幅度較小,兩組間差異顯著(P<0.05);對照組動物BAEP反應閾無明顯改變(見表1)。2.2組織化學檢測光鏡下觀察正常豚鼠耳蝸螺旋韌帶鋪片血管紋細胞和毛細血管壁細胞的SDH顯色呈深紫藍色,分布均勻,血管紋細胞及毛細血管壁均能明顯辨認,細胞膜及血管壁邊界清楚(見副封1,圖1),與文獻報道一致^[4]。GE組耳聾動物耳蝸血管紋細胞SDH顯色明顯變淡或消失,部分血管紋細胞膜邊界模糊(見副封1,圖2),表明血管紋細胞和毛細血管壁細胞SDH活性受到抑制,細胞受到不同程度的損害。針刺組耳聾動物血管紋細胞及毛細血管壁細胞SDH顯色亦變淡,但較GE組輕,血管紋細胞及毛細血管壁能清楚辨認(見副封1,圖3),表明SDH受到輕度抑制,細胞無明顯損害。標本的染色程度用分光光度計測定,吸收波長為450 μm,各組標本的吸光度(±s):對照組為0.0261±0.00162;GE組為0.0138±0.00313;針刺組為0.0198±0.00286;GE組和針刺組比較,差異具有非常顯著性意義(P<0.01)。

3討論

氨基糖甙類抗生素是第十七屆國際聽力學大會明確的18種致聾藥物中最重要的一種^{[5]。因該類抗生素是臨床上常用的藥物,故引起的耳聾患者仍不斷增加,防治其耳毒性仍是一個重要課題。該類抗生素耳毒性機制學說較多,對內耳酶的影響是耳毒性機制之一。Gratacap比較了該類抗生素對豚鼠耳蝸血管紋與螺旋器超微結構的損害,發現毛細胞的損害主要在溶酶體,而血管紋的損害主要在線粒體[6],SDH是線粒體酶(亦稱呼吸酶)的標志酶,是催化檸檬酸循環中琥珀酸與延胡酸之間的反應酶,該酶的活性改變反映了線粒體的功能變化[7]。文獻報道較多的是氨基糖甙類抗生素對耳蝸毛細胞SDH的抑制作用,對血管紋SDH變化報道較少。本結果表明該類抗生素對血管紋SDH有抑制作用,與文獻報道一致[2]。血管紋SDH顯色變淡或消失,是由于SDH活性受到抑制,其組織化學反應減弱或中止所致,由此而引起細胞能量代謝障礙,需要能量的功能活動不能正常進行而受到損害。本實驗結果顯示SDH顯色變化與血管紋細胞的損害程度呈平行。臨床上針刺治療耳聾的有效程度報道不同,一般認為對輕度及早期耳毒性抗生素引起的耳聾治療效果較好[8,9]。本實驗結果表明針刺有預防GE耳毒性的作用。針刺防治耳聾的機制是一個非常復雜的問題,目前所知甚少。針刺除能提高大腦聽覺中樞的興奮性外,不能排除對內耳病理過程的康復作用[10]。文獻報道針刺有保護耳蝸酸性磷酸酶、ATP酶和SDH的活性已表明存在這種康復功能[1,2]}。本實驗結果表明電針能減輕GE的耳毒性作用;亦提示電針減輕GE耳毒性與對耳蝸血管紋細胞SDH的保護作用有關。由于電針保護了SDH活性,維持了線粒體的能量代謝功能,保證了細胞的需能功能,降低GE對血管紋細胞的損害,使血管紋的正常功能得以維持。我們以前實驗結果表明電針對耳蝸毛細胞的SDH有保護作用^[2],能降低GE對耳蝸毛細胞的損害作用。這些實驗結果提示保護耳蝸SDH的活性,可能是針刺能降低GE耳毒性的機制之一。

4參考文獻

1張毅,董建勇.針刺對豚鼠鏈霉素致內耳損傷后期耳郭反射閾值ATPase、ACP活性的影響.甘肅中醫,1995;8(2):39

2康頌建,曾兆麟,史獻君,等.電針對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸內琥珀脫氫酶的影響.中國中西醫結合雜志,1998;18(6):362

3杜卓民.實用組織學技術.北京:人民衛生出版社,1982:322

4孫愛華,王通義,張義聲,等.大鼠耳蝸表面標本制備技術.中華耳鼻咽喉科雜志,1988;23(2):90

5葛賢錫.第十七屆國際聽力學大會簡況.國外醫學·耳鼻咽喉科學分冊,1985;9(5):274

6Gratacap B, Charachon R, Stoeber P. Results of an Ultrastructural Study Comparing Stria Vascularis with Organ of Corti in Guinea Pigs Treated with Kanamy-

cin Acta Otolaryngol.1985;99(3～4):339

7武內忠男,小川和朗主編.朱逢春譯.新酶組織學.北京:人民衛生出版社,1983:62

8鄭魁山,孟昭敏,鄭俊江,等.針刺治療鏈霉素中毒性耳聾40例臨床觀察.中國針灸,1989;9(3):15

9孫德利,劉元亮,方劍喬,等.不同穴位電針治療卡那霉素中毒性聽力損害的實驗研究.針刺研究,1995;20(3):62

10史美育,曾兆麟,施建蓉,等.針刺對豚鼠皮層聽覺中樞興奮性的影響.上海針灸雜志,1997;16(3):29

(吸光度由聶恒環老師協助測定,特此致謝)

(修回日期2000-06-16,齊淑蘭發稿)