混合型飼料添加劑液態亞洲薄荷素油·桉葉油含量檢測方法研究

林章秀 廈門惠盈動物科技有限公司 福建廈門 361023

隨著社會經濟的發展和人民生活水平的不斷提高， 人們對安全優質的動物性食品的需求量也日益增加。 然而，目前食品安全事件不斷曝光，食品安全問題日益突出，人們對食品安全的呼聲越來越高，安全、 高效和環境友好型的飼料添加劑已成為飼料行業的大勢所趨。我國具有豐富的中草藥資源，民間應用中草藥來防治動物疾病有著悠久的歷史。 中草藥取自天然動植物產品，保持了其成分、結構的自然狀態和生物活性，其有效成分與藥理作用密切相關。有效成分及其藥理功能，是防治動物疾病的物質基礎。薄荷腦是亞洲薄荷素油的主要成分， 具有特殊的芳香、辛辣感和涼感，歸肺、肝經，有發散風熱，清利咽喉，透疹解毒，疏肝解郁和止癢等功效；在雞養殖上應用，具有緩解呼吸道黏膜腫脹的問題，對雞只因飲水不足、飼料積存嗉囊、接種疫苗后出現呼吸問題等誘發的呼吸道積痰癥狀有特效， 通過刺激呼吸道絨毛活動來化痰。是農業部批準使用的食品香料，可作為飼料添加劑使用。 薄荷素的測定方法主要有GB/T 12652 亞洲薄荷素油[1]、GB 8319 食品添加劑 亞洲薄荷素油[2]、《中華人民共和國藥典》[3]。

桉葉油，主要成分為1，8-桉葉素，具有1，8-桉葉素的特征香氣，稍帶有樟腦樣氣息和辛辣涼味，具有殺菌作用及有一定防霉及殺菌防腐作用。 已證明1，8-桉葉素有很強的抗菌活性， 能增強動物體對營養物質的消化吸收能力， 提高生長性能和飼料利用率。桉葉油是農業部批準使用的食品香料，可作為飼料添加劑使用。 目前1，8-桉葉素的檢測方法主要有GB 1886.33 食品安全國家標準 食品添加劑 桉葉油（藍桉油）[4]。

對于同時檢測薄荷腦和1，8-桉葉素的方法尚未見報道，本研究開發出采用氣相色譜法（GC-FID）同時檢測液態亞洲薄荷素油·桉葉油樣品中的特征組分薄荷腦 （CAS：89-78-1） 和1，8-桉葉素（CAS：470-82-6）的方法，試驗證明，該方法準確快捷、操作簡單，可以用于液態亞洲薄荷素油·桉葉油樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 氣相色譜儀，配氫火焰離子化檢測器-FID 及配套工作站 （北京普析通用儀器）；MS105DU 分析天平（梅特勒-托利多）；XH-CA 旋渦混均器（無錫沃信儀器制造有限公司）；超聲波處理器（廣東固特超聲股份有限公司，功率：240 W）。

1.2 材料與試劑 無水乙醇（分析純）、甲醇（分析純）、三氯甲烷（分析純）、 薄荷腦對照品（CAS:89-78-1）、 1，8-桉葉素對照品 (桉油精對照品，CAS：470-82-6)。稱取一定量的對照品，用無水乙醇溶解、定容，并逐級稀釋成試驗所需的濃度，再配制成相應濃度的薄荷腦、1，8-桉葉素混合標樣。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 檢測器：FID 檢測器；毛細管色譜柱：ZB-WAX 柱，0.25 μm× 0.32 mm× 30 m； 氣體總類包括，載氣：氮氣（純度不小于99.999%），焰氣：氫氣（純度不小于99.99%），助焰氣：空氣（壓縮空氣）；進樣口：230 ℃；檢測器：300 ℃；程序升溫：柱箱，初溫100 ℃，升溫速度為10 ℃/min，終溫300 ℃，保留時間3 min；氣體流量：柱流量1.85 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹氣30 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：20:1。

1.3.2 樣品前處理 稱取樣品0.4～0.5 g （精確至0.0001 g），置于50 mL 容量瓶中，用無水乙醇溶解，超聲10 min，冷卻，用無水乙醇定容，搖勻。 經0.45 μm 微孔濾膜過濾，吸取1 μL 標準儲備液和樣品稀釋液分別注入氣相色譜儀，根據保留時間定性，外標法定量。

1.3.3 測定 按1.3.1 色譜條件， 待儀器穩定后，對標準溶液和試樣溶液進行氣相色譜分析。

1.3.4 系統適應性試驗 按1.3.1 色譜條件，分別吸取空白基質溶液、對照品溶液、樣品溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀中測定。

2 結果與分析

2.1 色譜方法條件的選擇 分別吸取空白基質樣品溶液、混合對照品溶液、樣品溶液、空白基質加標樣溶液，按所述色譜條件測定。 結果表明，空白基質樣品在目標化合物保留時間處無雜質峰干擾， 樣品其質中其它成分不干擾目標化合物測定， 并且能夠在最短時間內實現目標化合物完全分離， 方法特異性強，適用于混合型飼料添加劑中薄荷腦和1，8-桉葉素含量測定，見圖1-圖4。

圖1 空白基質樣品氣相色譜圖

圖2 對照品薄荷腦和1,8-桉葉素氣相色譜圖

2.2 方法的線性范圍及相關系數 將薄荷腦、1，8-桉葉素的標準系列溶液在上述氣相色譜條件下進樣分析，以標準溶液濃度為橫坐標、對應的峰面積為縱坐標，擬合標準曲線，得到相應的線性回歸方程及相關系數，根據3 倍噪比計算方法的檢測限，以10 倍信噪比計算方法的定量限。 結果見表1、圖5-圖6。

測定薄荷腦的線性范圍及相關系數：y=ax+b，其中 a =1734190，b =-16976.04，R2=0.9999360，R =0.999968。

測定1，8-桉葉素的線性范圍及相關系數：y=ax+b， 其中a=2453878，b=-20477.88，R2=0.9999549，R=0.9999775。

圖3 樣品中薄荷腦和1,8-桉葉素氣相色譜圖

圖4 空白基質加標樣氣相色譜圖

表1 2 種目標化合物線性方程及相關系數

圖5 測定薄荷腦的線性作圖

圖6 測定1,8-桉葉素的線性作圖

進行外標法定量測定。校準曲線：線性，零點：不強制，見表2。

表2 外標法定量測定設計

2.3 方法的回收率和精密度 向空白基質樣品中分別添加Ⅰ(10 mg/g)、Ⅱ(20 mg/g)、Ⅲ(50 mg/g)三個濃度水平的混合標樣，每個水平進行6 次平行測定，回收率和精密度結果見表3，色譜圖見圖4。

表3 加標回收試驗結果（n=6）

2.4 溶液穩定性試驗 按上述前處理方法制備樣品溶液 （薄荷腦50 mg/g、1，8-桉葉素40 mg/g），密封， 保存在室溫環境中， 隔2 h、4 h、8 h、24 h、48 h按前述方法測定2 種目標化合物含量，結果見表4，表明樣品溶液在48 h 內穩定。

2.5 不同色譜柱的選擇 色譜柱的選擇[5]對分析方法是否成功是一個很重要的問題，固定相類型、目標化合物的化學結構和組分極性， 是色譜柱選擇主要考慮的因素。混合型飼料添加劑液態亞洲薄荷素油·桉葉油是以亞洲薄荷素油（薄荷腦）、桉葉油（1，8-桉葉素）、吐溫80、聚二醇400 等乳化制成的。 因此，色譜柱選擇要考慮薄荷腦、1，8-桉葉素的分子結構，還要考慮基質干擾等因素。 本試驗采用了3 種不同極性的色譜柱：ZB-35 毛細管色譜柱、ZB-WAX 毛細管色譜柱、ZB-624 毛細管色譜柱，綜合考慮了峰形、靈敏度、檢測時間、基線漂移等色譜分析因素，ZBWAX 毛細管色譜柱效果最好并選為本試驗用色譜柱。

2.6 柱溫和柱流量的優化選擇 為了提高分離效果， 應對升溫程序和色譜柱的氣體流量進行優化選擇。本研究反復試驗比較了不同的初始溫度、升溫速率、 柱流量后， 確定儀器參數為： 進樣口溫度：230 ℃；色譜柱升溫程序：100 ℃保持10 min，每分鐘升10 ℃，至150 ℃保持3 min；檢測器溫度：300 ℃。氣體流量：柱流量1.85 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min，尾吹氣30 mL/min。

2.7 提取溶劑的選擇[6]選擇3 種試劑作為樣品的提取溶劑：甲醇、無水乙醇、三氯甲烷。 試驗表明，甲醇、 無水乙醇、 三氯甲烷均能很好地提取目標化合物。 但由于三氯甲烷、甲醇毒性大；三氯甲烷為易制毒試劑，不易購買；乙醇毒性小，價格便宜，易于購買。 所以，本試驗選擇無水乙醇作為提取溶劑。

2.8 實際樣品測定 用公司生產的混合型飼料添加劑液態亞洲薄荷素油·桉葉油混合劑進行測定。準確稱取樣品0.4～0.5 g （精確至0.0001 g）， 置于50 mL 容量瓶中，用無水乙醇溶解，超聲10 min，冷卻，用無水乙醇定容，搖勻。采用GC-FID 測定，色譜圖見圖3，測定結果與產品成分分析保證值相符。

表4 樣品溶液穩定性

3 結 論

本研究建立的可同時測定薄荷腦、1，8-桉葉素的氣相色譜法， 具有樣品前處理簡單及強特異性的優點，具有較寬的線性范圍及顯著的線性關系，加標回收率高，重現性好；使用儀器設備普及率高，可在混合型飼料添加劑液態亞洲薄荷素油·桉葉油混合劑的質量檢測及企業標準制定中加以推廣應用。