ELISA法檢驗乙肝標志物影響因素的探討

王 璐 河南大學淮河醫(yī)院檢驗科，河南省開封市 475000

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者（HBsAg攜帶者）超過2.8億，我國約占9300萬［1］。多數(shù)帶菌者無癥狀，其中1／3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。目前我國有乙肝患者3000萬［2］。

目前，酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme－Linked Immunosorbent Assay，簡稱酶免）是臨床實驗室最常用的一種檢驗乙肝的標記免疫方法［3］。ELISA在基礎(chǔ)研究和常規(guī)的臨床實驗室中有著廣泛的適用性，具有操作簡便、靈敏度較高、試劑成本低、環(huán)保、適于大批量人群抗原抗體篩查等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于肝炎病毒、艾滋病毒篩查和激素等項目的檢測。但是如果忽視影響其結(jié)果的因素，難免造成假陽性或假陰性。所以了解影響因素對減少差錯事故的發(fā)生是極其必要的。

1 試劑因素

試劑質(zhì)量是影響檢測結(jié)果的直接因素，對于生產(chǎn)廠家出售的試劑盒，其抗原抗體純度、抗體的親和力、滴度和特異性、標記物的比活性或免疫活性等［4］，均對測定結(jié)果產(chǎn)生直接影響。試劑盒的穩(wěn)定有效期、運輸條件及儲存方式等也均會對結(jié)果有一定程度影響。

試劑靈敏度主要取決于抗體親和常數(shù)（E值）和抗體的滴度，還取決于標準曲線的斜率和零標準管的重復(fù)性兩個因素［4］。因此，重視試劑質(zhì)量，才能有效地進行室內(nèi)質(zhì)控以及參加室間質(zhì)量評價，使結(jié)果具有可比性。

此外，試劑應(yīng)冰箱保存。使用前要平衡至室溫，不同批號的試劑組不宜交叉使用，試劑打開后要1周內(nèi)用完，應(yīng)同時做室內(nèi)質(zhì)控，確保結(jié)果的可靠性。

2 標本因素

影響ELISA法檢測乙肝標志物的因素很多，除上述因素外，還與內(nèi)源物質(zhì)（包括溶血、脂濁、類風濕因子、甲胎蛋白、自身抗體等）干擾和外源物質(zhì)（如血液抗凝劑）的干擾有關(guān)［5］。另外試劑的運輸、保存、使用者素質(zhì)［6］以及一步法檢測HBsAg的鉤狀效應(yīng)［5］等都影響到檢測質(zhì)量。

因此，收到標本后要認真查對，對不符合要求的標本和申請單要拒收，建立拒收登記制度，合格標本要及時分離、及時檢測，避免溶血。如條件不允許，將標本置于4℃冰箱保存5d內(nèi)檢測或1周后檢測需低溫凍存（－20℃），但不可反復(fù)凍融，并在檢測前要輕柔混勻，不可強烈振蕩。

3 操作過程中的影響因素

3.1 操作前要檢查一些物理因素 如室溫（18～25℃）孵育箱的溫度，不同的溫育環(huán)境會影響到檢測結(jié)果。明確孵育時間和洗滌次數(shù)等。

3.2 正確使用加樣器 應(yīng)垂直加入標本或試劑，避免刮擦包被板底部；加樣要準，避免液體外濺使血清殘留在反應(yīng)壁上，加樣吸頭要用一次性的，避免交叉污染。

3.3 洗板時的注意事項 洗板時（手工洗和機洗），應(yīng)嚴格按說明書的次數(shù)和浸泡時間，不要使洗液外溢，造成孔間污染，導(dǎo)致假陰性或假陽性。洗板過程也是影響結(jié)果的因素之一［7］，沖力過大，會造成酶結(jié)合物丟失，使吸光度值偏低。

3.4 顯色劑不可過多 顯色要避光反應(yīng)，要放夠時間，顯色時間不夠，可使一些滴度低的標本反應(yīng)不出來，造成假陰性。

3.5 顏色終止條件［8］影響實驗的準確性 由于ELISA實驗終止劑選用引起的持續(xù)發(fā)展的顏色加深影響了陰性和弱陽性樣品及定量檢測樣品的結(jié)果，特別在大批樣品需較長時間進行讀數(shù)時，這種潛在的顏色逐漸加深現(xiàn)象成為影響結(jié)果的重要因素。

4 環(huán)境因素

實驗室環(huán)境也是保證結(jié)果可靠的因素之一，應(yīng)做好以下控制：（1）通風、采光與防塵；（2）控制溫度及濕度，環(huán)境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異，應(yīng)使用系統(tǒng)空調(diào)進行控溫，并要求控制空氣濕度為35%～65%之間；（3）消除噪音與電磁干擾；（4）穩(wěn)定水電，實驗過程中應(yīng)采用蒸餾水（純水）或經(jīng)軟化處理的自來水。

綜上所述，ELISA檢測結(jié)果是受多方面因素影響的，我們要有一個良好的工作環(huán)境，提高個人工作責任心，提高質(zhì)量控制意識；建立SOP文件，建立完善的質(zhì)量體系以及標準化操作流程。在工作中總結(jié)經(jīng)驗，盡量避免或減少人為干擾因素對結(jié)果的影響。

［1］何愛玲.1757例血清乙肝五項指標檢測結(jié)果分析〔J〕.社區(qū)醫(yī)學雜志，2006，4（3）：46－47.

［2］彭文偉.傳染病學〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：21－44.

［3］李宏杰，朱峰，程家坤，等.ELISA競爭抑制法檢測Anti－Hbe試劑盒共系統(tǒng)檢測HbeAg結(jié)果分析〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2007，45（9）：15－17.

［4］于自正.現(xiàn)代醫(yī)學標記免疫學〔M〕.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：41－45.

［5］許斌，朱虎定.ELISA檢測HbsAg影響因素的探討〔J〕.臨床檢驗雜志，2000，18（4）：232.

［6］王露楠，王文麗，鄭懷競.一九九三年全國乙肝標志物免疫學檢驗室間評價〔J〕.肝臟病雜志.1995，3（1）：44.

［7］吳曉巖.臨床免疫實驗室室內(nèi)質(zhì)控影響因素分析〔J〕.中國免疫學雜志，2001，17（5）：277－280.

［8］楊崇先，郭北誠，麻卓云.比色時間對ELISA結(jié)果判讀的影響〔J〕.大理學院學報，2003，2（增刊）：19－20.