豬源沙門氏菌的分離與耐藥性分析

傅水江 沈青靚 童旭棟 沈堅 金俊杰 侯鳳香

（1.浙江省紹興市柯橋區畜牧獸醫所，浙江紹興 312030；2.浙江省臺州市路橋區農業農村與水利局，浙江臺州 318050；3.浙江省溫州市農業科學研究院，浙江溫州 325006）

細菌耐藥性又稱抗藥性，指細菌對于抗菌藥物作用的耐受性。由于長期、廣泛和不合理、不規范使用抗菌藥物，導致該細菌的耐藥性日趨嚴重，甚至常出現多重耐藥菌。豬沙門氏菌常引起豬場中斷乳仔豬的敗血癥、腸炎腹瀉等，是豬場普遍存在的常在菌，也是大部分豬場中耐藥性較高，多重耐藥較嚴重的常見菌。同時，沙門氏菌屬的細菌大部分對人和動物均有致病性，是一種重要的人畜共患病，因不需要中間宿主，可在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接接觸傳播，常導致人類食物中毒。美國、瑞士等國家都曾不同程度的暴發了沙門氏菌的感染。本菌若未得到有效的控制，將會給人類生命健康安全帶來隱患。因此，開展沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性檢測在醫學、獸醫學、公共衛生安全等方面都具有重要意義。本文通過采集柯橋區內的三個規模豬場的生豬肛拭子，進行沙門氏菌分離和耐藥性調查，明確沙門氏菌的分離率及耐藥情況，為更好地控制沙門氏菌的傳播和耐藥性的產生提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

慶大霉素、頭孢唑啉、大觀霉素、多西環素、丁胺卡那、恩諾沙星、林可霉素、氟苯尼考、卡那霉素、環丙沙星、復方新諾明、紅霉素、鏈霉素等13種常用獸用抗生素紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。四硫黃酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、XLD 瓊脂平板，DNA Maker、Taq DNA聚合酶、dNTP 均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 樣品采集時間

2021 年9 月份從柯橋區苗仙生豬養殖場、柯橋區香逸生豬養殖場、柯橋區徐杏養殖場等3 個生豬養殖場內采集直腸內容物（用肛拭子插入肛門2～3cm，輕輕旋轉）將拭子放入Cary-Blair 運送培養基中，0～4℃保存，送檢（室溫運送時間不超過2h，4℃保存不超過24h）。

1.3 分離鑒定

采集3 個規模豬場的195 頭生豬采集195 份肛門拭子，按照《農業農村部關于印發<2019 年動物源性細菌耐藥性監測計劃>的通知》（農牧發〔2019〕 11號）進行菌株分離鑒定。先將拭子接種增菌液，培養18～24h，然后將菌液混勻，接種XLD 瓊脂平板上，37℃培養約16～20h，在XLD 瓊脂平板上的可疑菌落多呈粉紅色透明（少數黃色透明）近圓盤狀，邊緣光滑或不光滑，菌落多有黑心，直徑約為2～3mm。挑取可疑菌落，接種營養瓊脂平板進行純化，（36±1）℃培養16～24h。用接種環從營養瓊脂上挑選16～24h 的純培養物，置于0.5mL 滅菌生理鹽水中，12000r/min 離心2min，棄上清。再加0.5mL 滅菌水，懸浮并渦旋混勻，100℃沸水中煮沸10min 后，移至冰上，冷卻后以12000r/min 離心2min，取上清液進行PCR 鑒定。

1.4 藥敏試驗

參考美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）制定的標準[1]，采用K-B 紙片擴散法，每個平板貼5 個藥敏片，藥敏片邊緣距離不小于30mm，置37℃培養箱培養18h，測量抑菌圈半徑，根據標準做出耐藥性判定，即敏感、中介、耐藥，并計算耐藥率。

耐藥率=耐藥菌株數量/總菌株數量× 100%

2 結果與分析

2.1 藥物敏感性結果

對柯橋區3 個規模豬場195 份豬直腸拭子樣品進行沙門氏菌分離培養，經PCR 鑒定出46 株沙門氏菌，分離率為23.59%。藥敏試驗結果見表1。從表中可以看出，分離到的46 株沙門氏菌對13 種抗菌藥物均表現出不同程度的耐藥性。其中對林可霉素耐藥率最高，達100%；對紅霉素保持很高的耐藥率為84.78%；對鏈霉素、復方新諾明、多西環素耐藥率保持在41.30%～58.70%；對氟苯尼考、頭孢唑林、卡那霉素、環丙沙星的耐藥率在26.09%～34.78%；對丁胺卡那耐藥率最低，耐藥率為4.35%。

表1 豬源沙門氏菌分離株藥敏試驗結果

2.2 多重耐藥性結果

多重耐藥性結果見圖1。從圖中可以看出，在46株豬源沙門氏菌的分離株中，有0 株對所有13 種抗菌藥物均敏感；3 株對10 種抗菌藥物均耐藥（10R）；4 株對9 種抗菌藥物耐藥（9R）；6 株對2 種抗菌藥物耐藥（2R）；1 株對1 種抗菌藥物耐藥（1R），在受試菌株中，對3 種及以上抗菌藥物耐藥的菌株占84.78%（39/46）。每株菌至少對1 種抗生素有耐藥性，最高耐藥重數達10R，尚未發現對13 種抗生素全部耐藥的菌株。由此可見沙門氏菌多重耐藥情況在3 個場中均存在，目前雖然尚未發現對13 種藥物全部耐藥的細菌，但已經出現10 種抗生素耐藥的菌株，應當引起我們的極大關注。

圖1 豬源沙門氏菌對13 種抗菌藥物的多重耐藥性分布

3 討論

夏宇飛等從300 份豬源樣本分離到37 株沙門氏菌，分離率為12.33%[2]。劉楠楠等采集江蘇部分地區豬場200 份豬肛門拭子，分離到13 株沙門氏菌，分離率為6.50%[3]，均低于本試驗中23.59%的細菌分離率，不同地區不同養殖場的沙門氏菌耐藥性存在明顯的差異，可能與各豬場的飼養管理、疫病防控技術水平等有關。

對46 株豬源沙門氏菌進行耐藥試驗，結果顯示，豬源沙門氏菌都對林可霉素具有很強的耐藥性，耐藥率為100.00%，其次為紅霉素，耐藥率為84.78%。對丁胺卡那最為敏感，耐藥率為4.35%。對3 種及以上抗菌藥物耐藥的菌株占84.78%（39/46)，呈現多重耐藥性。王偉等從貴州省某規模化養豬場分離得到20株沙門氏菌，經藥敏試驗檢測紅霉素耐藥率為90.00%，環丙沙星耐藥率為20.00%與本文檢測結果相接近[4]。方忠意等從河南部分地區生豬屠宰場分離得到的45 株沙門氏菌，藥敏試驗檢測復方新諾明耐藥率為40.00%，與本文檢測結果相接近，恩諾沙星耐藥率為62.22%，慶大霉素耐藥率為57.78%，氟苯尼考耐藥率為46.67%與本實驗差異較大[5]；李月華等從6 個省分離得到89 株豬源沙門氏菌，藥敏試驗檢測慶大霉素耐藥率為43.82%，大觀霉素耐藥率為60.67%，四環素耐藥率為86.52%，多西環素耐藥率為85.39%，氟苯尼考耐藥率為64.04%，與本文檢測結果差異較大，多重耐藥率為83.15%，與本文檢測結果持平[6]。不同抗生素的耐藥性以及不用地區耐藥率的差異與豬場的發病情況、用藥習慣、管理水平、技術力量等因素有關。從中我們可以看出，豬場必須提高飼養養殖管理、疫病防控水平，有條件的及時進行藥敏試驗，依據藥敏試驗檢測結果，選用敏感藥物進行合理用藥、輪換用藥、交叉用藥；政府及監管部門應加強技術指導和抗生素的使用監管，減少或避免沙門氏菌耐藥性的不斷發展。

4 結論

通過對柯橋區3 個規模豬場195 份豬直腸拭子樣品進行沙門氏菌分離培養，獲得46 株沙門氏菌，細菌分離率為23.59%。

通過藥敏試驗結果顯示，豬源沙門氏菌都對林可霉素具有很強的耐藥性，耐藥率為100.00%，對丁胺卡那最為敏感，耐藥率為4.35%。同時通過多重耐藥性分析，所得菌對3 種及以上抗菌藥物耐藥的菌株占84.78%（39/46），呈現多重耐藥性。